新基因BRAP的克隆與功能研究.pdf

1、神經(jīng)肽在氣道高反應(yīng)或氣道炎癥發(fā)生過(guò)程中的作用越來(lái)越引起重視。蛙皮素樣肽(bombesin-like peptides BLPs)是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)功能的神經(jīng)肽。在哺乳動(dòng)物，目前已經(jīng)確認(rèn)的BLPs成員有胃泌素釋放肽(GRP)和神經(jīng)介素B(NMB)。與之對(duì)應(yīng)，哺乳動(dòng)物體內(nèi)BLPs受體家族已確認(rèn)3個(gè)成員，分別是GRP受體、NMB受體和蛙皮素受體亞型-3(bombesin receptor subtype3，BRS-3)。前二者分別與GRP和

2、NMB以高親和力結(jié)合并引起相應(yīng)生物學(xué)功能，而B(niǎo)RS-3的天然配體尚未確定，故屬孤兒受體，蛙皮素受體亞型-3是由399個(gè)氨基酸組成的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，在正常的大多數(shù)組織內(nèi)表達(dá)很低，其生物學(xué)意義、生物學(xué)效應(yīng)、基因表達(dá)調(diào)控目前不太清楚，而在發(fā)育中的肺組織及腫瘤組織中表達(dá)增高，提示BRS-3可能與細(xì)胞生長(zhǎng)、損傷修復(fù)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，BRS-3在肺和氣道上皮應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)過(guò)程中可能發(fā)揮作用，并進(jìn)一步對(duì)BRS-3的生物學(xué)功能、基因表達(dá)調(diào)控和BR

3、S-3天然配體進(jìn)行了一系列研究。細(xì)菌雙雜交技術(shù)顯示BRS-3可與多種蛋白發(fā)生相互作用，這些蛋白的功能分別與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、抗凋亡、細(xì)胞骨架、酪氨酸激酶等有關(guān)。免疫共沉淀同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種可與BRS-3發(fā)生相互作用的新蛋白，其生物學(xué)意義不清楚。本研究針對(duì)其中一種與BRS-3相互作用的新基因（暫命名蛙皮素受體激活蛋白bombesin receptor activated protein BRAP，基因庫(kù)序列號(hào)：NM-152734）的序列特征、生

4、物信息學(xué)及其功能進(jìn)行相關(guān)研究。
　　 目的：利用生物信息學(xué)技術(shù)，搜索克隆基因及預(yù)測(cè)基因功能等方法研究與蛙皮素受體亞型-3(Bombesin receptor subtype-3,BRS-3)相互作用的一個(gè)新基因BRAP的基本生物信息學(xué)特征，進(jìn)一步觀察BRAP表達(dá)蛋白的細(xì)胞亞定位以及在支氣管上皮細(xì)胞中的功能，為研究BRAP與BRS-3在支氣管上皮細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的超分子組裝奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴利用克隆基因分析軟件對(duì)BR

5、AP進(jìn)行生物信息學(xué)分析。⑵利用RT-PCR擴(kuò)增新基因BRAP的ORF，并克隆至pEGFP-C1載體，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pEGFP-C1/BRAP，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，同時(shí)以空白細(xì)胞和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對(duì)照，經(jīng)瞬時(shí)高效表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察其表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。以Western-blot法分析轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)情況。⑶構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(＋)/BRAP，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人的支氣管上皮細(xì)胞(Human bronchial epithe

6、lial cells,HBECs)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響；篩選穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1(＋)/BRAP HBEs株，觀察BRAP新基因?qū)χ夤苌掀ぜ?xì)胞損傷修復(fù)的影響。損傷修復(fù)測(cè)定采用在融合的支氣管上皮細(xì)胞單層上造成一小面積不規(guī)則缺損，用顯微視頻分析系統(tǒng)每隔4h測(cè)量缺損面積一次，繪制時(shí)間與修復(fù)面積的直線(xiàn)回歸方程，直線(xiàn)的斜率的絕對(duì)值為損傷修復(fù)指數(shù)，斜率越大，損傷修復(fù)速度越快。
　　 結(jié)果：①BRAP cDNA全長(zhǎng)6721

7、bp，編碼354個(gè)氨基酸，精確定位于6p21.2，并在正常胎兒腦組織、胎肺、胎肝、人胚干細(xì)胞、腦星形細(xì)胞瘤、前列腺癌、肺癌等組織中高表達(dá)，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該基因有跨膜區(qū)域。②構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pEGFP-C1/BRAP，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序證實(shí)與GENE BANK數(shù)據(jù)庫(kù)的序列一致，熒光標(biāo)記蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其表達(dá)產(chǎn)物定位于胞膜和胞漿，在轉(zhuǎn)染重組子的細(xì)胞中其蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。③構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(＋)/BRAP

8、，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序證實(shí)與GENE BANK數(shù)據(jù)庫(kù)的序列一致；流式結(jié)果提示重組質(zhì)粒pcDNA3.1(＋)/BRAP對(duì)細(xì)胞周期的S期＋G2提高25％；并促進(jìn)了HBECs的損傷修復(fù)的能力。
　　 結(jié)論：⑴生物信息學(xué)分析結(jié)果提示提示BRAP具有信號(hào)分子特性，可能參與細(xì)胞生理功能的調(diào)控。⑵該基因表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位于胞膜和胞漿，提示該蛋白可能是胞漿蛋白，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。⑶BRAP在HBECs高表達(dá)后促進(jìn)HBECs細(xì)胞分裂周期