煙草NtLEA1基因的克隆與功能研究.pdf

1、煙草 NtLEA1 基因的克隆與功能研究 重慶大學碩士學位論文 （學術學位） 學生姓名：祝慧敏 指導教師：夏慶友 教 授 專 業(yè)：生物學 學科門類：理 學 重慶大學生命科學學院 二 O 一三年四月重慶大學碩士學位論文 中文摘要 I 摘 要 胚乳后期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein

2、s，LEA 蛋白）是一類在種子胚胎發(fā)育晚期豐富聚集的蛋白質。LEA 蛋白是一類多家族蛋白，并在生物界廣泛分布。LEA 基因除在正常種子發(fā)育后期豐富表達外，高鹽、干旱和冷害等環(huán)境因素及脫落酸（ABA）等植物激素也可誘導一些 LEA 基因在葉片、根等植物營養(yǎng)器官中表達。研究表明，LEA 蛋白與植物抗逆密切相關，LEA 基因的過表達能提高受體植株的耐鹽、耐干旱能力。煙草作為一種重要的模式植物，普遍用于研究其他植物的 LEA 基因的功能，但其自

3、身的 LEA 基因的相關研究尚未見報道。隨著煙草基因組測序工作的完成，挖掘信息，研究煙草 LEA 基因，探索其功能，對植物抗逆基礎研究領域具有重要意義，并有望通過遺傳育種手段提高煙草的抗旱耐鹽性。本研究結合生物信息學方法和分子克隆手段從煙草中克隆到一個 LEA基因，命名為 NtLEA1，并通過生物信息學分析、逆境脅迫的表達分析和轉基因煙草植株表型分析，來初步探索 NtLEA1 基因的功能，主要工作內容及成果如下： ① 結合生物信息學分析

4、方法，用番茄的 LEA 基因序列同源檢索煙草 EST 數(shù)據(jù)庫，EST 序列拼接得到預測的煙草 LEA 基因，通過分子克隆獲得目的基因的ORF 編碼區(qū)序列，總長度為 501bp，GC 含量為 51.5%，與番茄 LEA 基因序列相似度達 78%，命名為 NtLEA1 基因。該基因編碼 166 個氨基酸殘基，預測的蛋白質分子量為 17.3551kD， 等電點為 8.62， 不穩(wěn)定系數(shù)為 15.71， 親水性總平均值為-1.103。保守結構域

5、預測 NtLEA1 蛋白含有 7 個串聯(lián)重復的 11-氨基酸保守基序，屬于第三組 LEA 蛋白。生物信息學分析表明 NtLEA1 蛋白二級結構以 α 螺旋結構為主，具有高親水性和熱穩(wěn)定性。 啟動子序列分析表明 NtLEA1 基因上游序列中含 1 個胚乳表達元件（Skn-1 motif）、2 個 ABA 應答元件（ABRE）、1 個 MeJA 響應元件（CGTCA-motif）、1 個水楊酸響應元件（TCA-element）、1 個高溫脅

6、迫應答元件（HSE）、1 個干旱應答元件（MBS）及 2 個光調控元件（Box 4）。 ② 半定量 PCR 分析表明 NtLEA1 基因的表達受 PEG 模擬干旱脅迫、ABA、鹽脅迫的誘導，幾乎不受冷脅迫的誘導，其中受鹽脅迫誘導最為強烈，由此推斷NtLEA1 基因與煙草抗逆相關。 ③ 為進一步探索 NtLEA1 基因的功能，本研究構建了一個由 CaMV35S 啟動子驅動的植物雙元表達載體 pCXSN-NtLEA1，并由根瘤農桿菌 LBA