水稻深綠穗基因DGP1的克隆與功能研究.pdf

1、光合作用是水稻籽粒生物量合成的主要來(lái)源。葉綠素是最重要的光合色素，其含量在一定范圍內(nèi)與光合速率成正比。在前期研究中，我們從水稻輻射誘變庫(kù)中篩選到一個(gè)深綠穗突變體dgp1（dark green panicle1），其葉色穗色深綠，葉綠素含量較高;利用圖位克隆技術(shù)將dgp1基因精細(xì)定位在水稻1號(hào)染色體90kb物理區(qū)間，并確定候選基因。本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證DGP1候選基因功能，克隆DGP1基因，并對(duì)該基因的組織表達(dá)、亞細(xì)胞定位及生

2、物學(xué)作用進(jìn)行了分析。
　　首先，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，在DGP1基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)了4個(gè)突變靶點(diǎn)，對(duì)野生型水稻日本晴的DGP1基因進(jìn)行敲除，共獲得135株轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定，獲得了多種dgp1純合突變體，其葉色與穗色都呈現(xiàn)深綠色。同時(shí)，利用野生型日本晴，構(gòu)建DGP1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，其表型剛好與dgp1突變體相反，葉色和穗色都變淺。這些結(jié)果都證實(shí)了該候選基因就是DGP1。
　　接著，利用半

3、定量RT-PCR分析了DGP1基因的組織表達(dá)情況，表明該基因在葉、穗、鞘、莖等綠色器官中表達(dá)量較高，而在根中檢測(cè)不到表達(dá)。同時(shí)，克隆了DGP1基因啟動(dòng)子（DGP1Pro），構(gòu)建了DGP1Pro∷GUS轉(zhuǎn)基因水稻，經(jīng)組織化學(xué)染色，進(jìn)一步驗(yàn)證了DGP1基因的表達(dá)模式。為了對(duì)DGP1基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了DGP1與GFP熒光蛋白融合表達(dá)的載體，在煙草葉表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DGP1基因在細(xì)胞核、質(zhì)、膜中都有表達(dá)。
　　最后，采用d

4、gp1純合突變體、DGP1過(guò)表達(dá)植株及其野生型對(duì)照日本晴，分別測(cè)定了劍葉、穗的葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值（反應(yīng)光合能力）。與野生型對(duì)照相比，dgp1突變體的葉綠素含量和Fv/Fm值都顯著增加，而DGP1過(guò)表達(dá)植株則剛好相反。而且，水稻地上部分的生物量測(cè)定結(jié)果也表明dgp1突變體的鮮重和干重都顯著高于野生型，而DGP1過(guò)表達(dá)植株則顯著低于野生型。
　　綜上所述，我們通過(guò)轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，克隆DGP1基因，并分析其生物學(xué)功能