水稻果膠裂解酶基因DEL1的克隆和功能研究.pdf

1、果膠是植物細(xì)胞壁的重要組成成份，也是植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的多糖。果膠裂解酶作為眾多果膠降解酶之一，能夠通過β-消除作用將去酯化的同聚半乳糖醛酸降解成一個短鏈的果膠分子和一個4，5-不飽和寡聚半乳糖醛酸。到目前為止，盡管許多植物中都報道了果膠裂解酶基因的功能，主要表現(xiàn)在參與花粉、花藥和雌蕊的發(fā)育、果實軟化及成熟、抗病和植物器官或組織發(fā)育等方面，但在水稻中功能還鮮有報道。本研究在水稻甲基磺酸乙酯(EMS)誘變突變體庫中篩選到一個水稻矮稈、

2、葉片早衰突變體，命名為dell(dwarf and early-senescence leaf1)。通過生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)分析等試驗方法，剖析了其突變表型變化的分子機理。主要研究結(jié)果如下:
　　1.突變體del1在整個生育期表現(xiàn)出發(fā)育緩慢、植株矮小、根長變短、分蘗數(shù)減少等表型。石蠟切片分析結(jié)果表明，造成突變體del1植株矮小的原因是細(xì)胞數(shù)目減少導(dǎo)致的。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明突變體del1細(xì)胞數(shù)目減少是由于

3、細(xì)胞周期G1期受到阻滯引起的;
　　2.突變體del1同時也表現(xiàn)出葉片早衰的表型，在播種后5天葉尖及葉片邊緣發(fā)生黃化，隨著生長發(fā)育葉的進(jìn)行，葉片衰老表型更加嚴(yán)重，到了成熟期葉尖甚至出現(xiàn)撕裂表型。透射電鏡觀察突變體del1中葉綠體出現(xiàn)部分降解，類囊體排列紊亂，片層排列不規(guī)則等現(xiàn)象。同時，突變體del1中葉綠素含量和光合作用都顯著下降，衰老相關(guān)基因的表達(dá)顯著上升。臺盼藍(lán)染色及TUNEL實驗表明，突變體del1衰老的葉片中細(xì)胞程序化死亡

4、增加;NBT和DAB染色觀察發(fā)現(xiàn)，del1突變體中活性氧含量顯著升高，且電解質(zhì)滲透率也顯著升高。同時，活性氧相關(guān)酶活性及清除活性氧相關(guān)基因也顯著升高。這些結(jié)果表明，突變體del1葉片的衰老主要是由于活性氧的積累導(dǎo)致的;
　　3.遺傳分析表明，del1是由單一核基因控制的隱性性狀。以del1為母本，TN1為父本雜交獲得F2定位群體，選取30株突變表型的單株進(jìn)行初定位，將DEL1定位在10號染色體長壁上位于標(biāo)記M1和M14之間。進(jìn)一步

5、擴大群體（1081株突變表型單株）將DEL1定位于標(biāo)記M7和M8之間約45kb的物理距離范圍內(nèi)，該區(qū)間包含8個開放閱讀框。并進(jìn)一步通過測序發(fā)現(xiàn)第五個開放閱讀框的第三個外顯子發(fā)生一個堿基替換（G替換成T），導(dǎo)致氨基酸由色氨酸(Trp)變成亮氨酸(Leu)。序列分析表明DEL1編碼一個果膠裂解酶前體基因，cDNA全長為1476bp，編碼491個氨基酸。遺傳互補實驗證明，DEL1基因能夠恢復(fù)矮稈和葉片早衰的表型;
　　4.生物信息學(xué)分析

6、DEL1蛋白序列含有一個PelC結(jié)構(gòu)域，且保守位點與植物同源性非常高。進(jìn)化分析表明，DEL1與擬南芥業(yè)已報到的易感白粉病PMR6基因在進(jìn)化上親緣關(guān)系很近，但DEL1卻沒有表現(xiàn)出抗病的特性，表明果膠裂解酶基因在單子葉和雙子葉植物中已出現(xiàn)功能分化;
　　5.DEL1基因在水稻各個組織器官廣泛表達(dá)。其中，在莖，根和鞘等伸長部位表達(dá)量很高;
　　6.果膠酶活性實驗表明，突變體del1的酶活性要較野生型顯著降低。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變

7、體del1細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，胞間層和次生細(xì)胞壁厚度顯著下降，而初生細(xì)胞壁顯著升高。同時，果膠、纖維素、半纖維素及7種中性單糖都發(fā)生了顯著的變化。免疫組織化學(xué)實驗表明，突變體del1果膠甲酯化顯著升高;
　　7.轉(zhuǎn)錄組分析表明，突變體del1中許多細(xì)胞壁相關(guān)和衰老相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化，表明DEL1可能通過間接的方式參與水稻植物發(fā)育和葉片衰老相關(guān)的通路中。
　　以上結(jié)果說明:突變體del1矮稈、早衰表型是由于果膠裂解酶基