水稻CCT家族基因的功能研究和Hd1的重新克隆.pdf

1、水稻開花期決定水稻的地區(qū)適應(yīng)性，同時影響了水稻的產(chǎn)量。而開花期和產(chǎn)量，作為兩個最重要的農(nóng)藝性狀在現(xiàn)代栽培稻的馴化和進(jìn)化過程中都受到了選擇。水稻的開花期是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制，在水稻復(fù)雜的開花分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，涉及了許多含有CCT結(jié)構(gòu)域的基因。在水稻中共有41個CCT家族基因，分為3個亞類:COL，CMF和PRR。其中，Hd1是擬南芥CO的同源基因同時是水稻中通過圖位克隆方法分離的第一個調(diào)控開花的基因，屬于COL亞類。水稻發(fā)育核心調(diào)

2、控基因Ghd7屬于CMF亞類。在調(diào)控水稻高緯度種植中起主要作用的Ghd7.1/PRR37屬于PRR亞類。Hd1，Ghd7和Ghd7.1均同時控制水稻開花期，株高和產(chǎn)量。迄今為止已經(jīng)有13個CCT家族基因被報道過，它們都調(diào)控水稻的開花，同時其中一些基因還涉及水稻產(chǎn)量，株高，非生物脅迫和晝夜節(jié)律調(diào)控。CCT家族基因具有豐富的自然變異，在馴化和改良過程中經(jīng)歷多次自然和人工的選擇。幾個重要CCT家族基因的等位基因顯示具有地理分布特性（如Hd1，

3、Ghd7和Ghd7.1），與產(chǎn)量潛力高度相關(guān)。CCT家族基因的功能鑒定和分子機(jī)制的研究將有助于完善水稻開花的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并最大限度地發(fā)揮其對水稻生產(chǎn)的貢獻(xiàn)。
　　為了更高效地鑒定更多的CCT家族開花基因，我們使用了CRISPR/Cas9技術(shù)，通過轉(zhuǎn)基因創(chuàng)建了水稻41個CCT家族基因的突變體。在T0代突變體中，平均的突變頻率接近60％，其中有10％左右的純合或雙等位突變。但不同基因產(chǎn)生的突變頻率差異較大，這可能與基因的二級結(jié)構(gòu)或靶位點

4、的位置有關(guān)。在長日照條件下，13個已報道功能的CCT基因中只有4個在突變體中出現(xiàn)與之前報道相似的表型，其中Ghd7和DTH2突變體同時出現(xiàn)開花期和株高的表型，而Hd1和OsCo110僅出現(xiàn)了株高的表型。同時我們發(fā)現(xiàn)有4個未報道的CCT家族基因（OsCCT3，OsCCT22，OsCCT38和OsCCT41）影響水稻開花。而OsCCT41，OsCCT5和OsCCT25影響水稻的株高表型。通過qRT-PCR我們發(fā)現(xiàn)CCT家族基因主要具有八種基

5、因表達(dá)模式，而基因的表達(dá)模式可能與功能冗余有關(guān)。本研究中通過親緣關(guān)系遠(yuǎn)近構(gòu)建的14組雙突材料均未出現(xiàn)明顯表型，所以CCT家族基因可能在調(diào)控水稻開花中功能冗余可能涉及多個基因。
　　我們構(gòu)建的珍汕97聚合Ghd7和Ghd8的材料在長日照條件下表現(xiàn)為極端晚花，但是在同樣具有有功能的Ghd7和Ghd8的自然品種93-11卻可以正常開花，我們利用兩者雜交構(gòu)建F2群體，后代中早花與晚花的比例剛好符合1∶3。然后我們通過圖位克隆的方法我們篩選

6、了跨越整個基因組的120個標(biāo)記并發(fā)現(xiàn)RM314具有多態(tài)性，同時它與Hd1緊密相關(guān)。進(jìn)一步的研究結(jié)果確定導(dǎo)致ZS97聚合Ghd7和Ghd8后表現(xiàn)為極端晚花的原因就是Hd1。隨后在構(gòu)建的一個93-11和珍汕97的F2群體中我們發(fā)現(xiàn)Ghd7，Ghd8和Hd1是群體中調(diào)控開花的主效基因，同時三基因間具有顯著的遺傳互作。通過對多份自然栽培品種和野生稻中Ghd7，Ghd8和Hd1的測序和核酸多態(tài)性分析，確定了多種基因的單倍型。同時通過與基于開花期和