水稻MAPKK家族基因克隆及轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、水稻是單子葉模式植物，同時也是世界上重要的糧食作物。水稻植株在其生長發(fā)育過程中受到多種外部脅迫，如病原物感染，干旱脅迫等多種生物和非生物脅迫；這些脅迫信號被植物接受，并通過信號網(wǎng)絡(luò)傳遞，最后引起細(xì)胞乃至組織的脅迫反應(yīng)。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）作為絲/蘇氨酸類蛋白激酶在真核生物中廣泛存在，在植物生長發(fā)育及生物非生物脅迫中發(fā)揮重要功能。由MAPK-MAPKK-MAP

2、KKK組成級聯(lián)系統(tǒng)，MAPK類激酶在細(xì)胞中主要通過特異的磷酸化機制以實現(xiàn)其功能。MAPKK作為特異的絲/蘇氨酸激酶，在級聯(lián)途徑中起到十分重要的作用，將信號從上游MAPK傳遞到下游MAPKKK，使其發(fā)揮作用激活下游反應(yīng)。 本研究從表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）和cDNA的數(shù)據(jù)比對搜尋到水稻OsMKK家族，克隆了六個水稻促分裂原活化蛋白激酶激酶（（mitogen-activated protein kinases kinases，MAPKK

3、）基因。使用ClustalX對MAPKK家族的預(yù)測氨基酸序列進(jìn)行了比對分析，并調(diào)查標(biāo)記其中11個主要的結(jié)構(gòu)域，其中特異的絲/蘇氨酸（T/SXXXXXS/T）結(jié)構(gòu)位于第七和第八結(jié)構(gòu)域之間。并根據(jù)預(yù)測的氨基酸序列繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹。同時發(fā)現(xiàn)克隆的六個基因分屬于不同的亞族，其中OsMKK1和OsMKK6屬于A亞族，OsMKK4和OsMKK5屬于C亞族，OsMKK9和OsMKK10-2屬于D亞族。 構(gòu)建了超表達(dá)載體，其中OsMKK1和Os

4、MKK6連接到pCAMBIA1304載體中，通過把載體中的GUS基因通過酶切去除，用目的基因取代以后在CaMV35S強啟動子后超量表達(dá)。在相同的原理下將OsMKK4，OsMKK5，OsMKK9連接到pCAMBIA1323載體，OsMKK10-2連接到pCAMBIA1321載體中。把其中的五個導(dǎo)入農(nóng)桿菌，并成功轉(zhuǎn)化水稻，獲得了T0代轉(zhuǎn)基因植株。對T0代植株進(jìn)行高通量快速的轉(zhuǎn)基因檢測，使用快速PCR的方法，結(jié)合潮霉素浸泡葉片，檢測轉(zhuǎn)基因陽性

5、植株。 對獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行研究分析，利用嵌入法接種紋枯病，檢測轉(zhuǎn)基因植株的抗病性，并統(tǒng)計形成病斑的長度，OsMKK3和OsMKK6對紋枯病表現(xiàn)出一定抗性，而OsMKK10-2則與對照無顯著性差異。同時利用指甲油影印法觀察轉(zhuǎn)基因植株的氣孔，與對照相比轉(zhuǎn)基因植株的氣孔數(shù)量變小，葉表面維管束發(fā)達(dá)，表明轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育發(fā)生受到一定影響。另外還檢測了轉(zhuǎn)基因植株離體葉片的失水速率，結(jié)合葉表面觀察結(jié)果，不同的轉(zhuǎn)基因株系失水速率有一