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文檔簡介
1、蚜蟲屬同翅目昆蟲,種類繁多,侵害目標(biāo)廣泛。它通過口器深入植物的韌皮部吸收營養(yǎng),并攜帶和傳播病毒,造成農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。植物抗蟲基因工程為控制害蟲的危害提供了新的途徑。利用MARs序列(Matrix attachment regios,MARs)是在染色體水平克服外源基因失活的一種有效策略。本研究采用同源擴增PCR技術(shù),從莧屬的野莧菜中分離和克隆新的莧菜凝集素家族基因,并對這個基因的結(jié)構(gòu)與功能進行研究,闡明在現(xiàn)代分子遺傳育種中引入
2、該基因的可能途徑和重要意義。通過構(gòu)建殺蟲融合蛋白基因,即將兩個抗蟲基因編碼序列通過接頭連接在一起,構(gòu)成可同時表達兩種抗蟲活性的融合蛋白,以期能延緩昆蟲抗性的發(fā)生,而且也增強了殺蟲活性。另外,在減少基因沉默的措施上,在目的基因的兩側(cè)增加基質(zhì)結(jié)合序列(MARs),以增強基因的表達能力。本研究取得的主要結(jié)果如下: 1.利用同源克隆的方法從野莧菜Amaranthus viridis L.中克隆到野莧菜凝集素基因(Amaranthus v
3、iridis aggllutinin,AVA)。轉(zhuǎn)基因煙草植株的抗蚜分析表明,表達野莧菜凝集素的轉(zhuǎn)基因煙草植株都不同程度地抑制了蚜蟲群體發(fā)展的速度,轉(zhuǎn)AVA和AVAc基因植株平均抑蚜率分別約為60.81%和50.63%。轉(zhuǎn)含有內(nèi)含子的AVA基因比不含內(nèi)含子的編碼區(qū)基因AVAc有更好的抗蚜性。AVA基因是莧菜凝集素基因家族的新成員,是一個有應(yīng)用前景的新的抗蟲基因。 2.本研究從三個不同品種的豌豆中分離到3個具有MARs序列特征的D
4、NA片段MMAR,DMAR,HMAR。利用GenBank同源性搜尋發(fā)現(xiàn)它們是新的未注冊的DNA序列。經(jīng)轉(zhuǎn)化煙草對GUS活性測定發(fā)現(xiàn),兩側(cè)順式重復(fù)連接MAR對外源基因表達的增強作用很明顯,MMAR、HMAR和DMAR都不同程度的提高了GUS的表達,分別為載體對照植株的4.16、3.66和2.08倍。但不同個體間表達水平差異仍然比較明顯。 3.通過構(gòu)建MAR-AVA-MAR植物表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化白菜,獲得抗蚜轉(zhuǎn)化植株。含
5、有AVA基因的白菜植株對桃蚜的群體發(fā)展有一定的抑制作用,在接種12天后的平均抑制桃蚜密度達55.8%;在轉(zhuǎn)基因抗性植株上觀察到有少量桃蚜若蟲死亡的現(xiàn)象。無MAR的轉(zhuǎn)基因植株平均桃蚜抑制率為34.3%。但含MAR的轉(zhuǎn)基因單株之間基因表達也仍存在一定的差異。從總體上來說含有MAR的轉(zhuǎn)基因白菜植株較不含MAR的轉(zhuǎn)化植株對桃蚜具有更明顯的抑制作用,且抗性程度與AVA基因的表達量呈正相關(guān)。 4.根據(jù)豇豆胰蛋白酶抑制劑CpT1和野莧菜凝集素
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