兩種新型家蠶凝集素基因的克隆及表達(dá).pdf

1、在昆蟲的免疫中，識(shí)別蛋白參與到對(duì)病原體的識(shí)別中。C型凝集素(C-type Lectin)是先天性免疫的模式識(shí)別受體，其含有1個(gè)或者多個(gè)糖基識(shí)別域(carbohydrate-recognition domain，CRD)。由于Ca2+在此類凝集素中是很重要的，所以此類凝集素稱為C型凝集素。C型凝集素在識(shí)別微生物表面的糖分子后，會(huì)通過激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)來清除入侵的微生物。
　　 本文以鱗翅目昆蟲家蠶(Bombyx mori)為實(shí)驗(yàn)材料

2、，首先鑒定了2個(gè)C型凝集素，命名為BmLectin-10和BmLectin-11，然后通過注射微生物的方法研究它們?cè)诿庖咧械淖饔?。研究結(jié)果如下：
　　 1.基因鑒定及序列分析：從家蠶基因組中預(yù)測(cè)了兩個(gè)C型凝集素，并用RT-PCR獲得了這兩個(gè)基因cDNA的全長序列。其中BmLectin-10為990bp，含有EPD和EPN基序，分析BmLectin-10的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該蛋白有兩個(gè)糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，一個(gè)短型的CRD結(jié)構(gòu)位于N端第16

3、到150個(gè)氨基酸，一個(gè)長型的CRD結(jié)構(gòu)位于C端第162到301個(gè)氨基酸。它的氨基酸序列和含有兩個(gè)CRD的C型凝集素是很相似的。BmLectin-10的氨基酸序列與煙草天蛾(Manduca sexta)immulectin-2的相似度達(dá)到96％，與棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)的相似度達(dá)到95％。
　　 BmLectin-11為810bp，含有QPD基序，分析BmLectin-11的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)含有

4、一個(gè)信號(hào)肽，位于第1到21個(gè)氨基酸；還有一個(gè)CRD結(jié)構(gòu)，位于第45到203個(gè)氨基酸，它和短型的CRD相似。BmLectin-11的氨基酸序列與果蠅(Drosophila melanogaster)的相似度達(dá)到96％，與岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)的相似度達(dá)到95％。
　　 2.組織特異性分析：本文選取五齡家蠶的中腸、頭、脂肪體、表皮、馬氏管、血淋巴、絲腺等組織，用RT-PCR的方法分析BmLectin-10和B

5、mLectin-11在不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmLectin-10在脂肪體中的表達(dá)量較高，在表皮和頭部中的表達(dá)較少；BmLectin-11在脂肪體的表達(dá)量高于在表皮中的。其他組織均無表達(dá)。
　　 3.C型凝集素對(duì)微生物的識(shí)別作用：用RT-PCR的方法研究微生物對(duì)BmLectin-10和BmLectin-11表達(dá)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌入侵后24h時(shí)BmLectin-10的相對(duì)表達(dá)量升高的極為顯著；在釀酒酵母入侵后6

6、h時(shí)BmLectin-11的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。這說明BmLectin-10可能對(duì)G-有特異的識(shí)別作用，BmLectin-11對(duì)真菌有特異的識(shí)別作用，而BmLectin-10和BmLectin-11對(duì)G+的識(shí)別作用不顯著。
　　 4.原核表達(dá)：構(gòu)建重組質(zhì)粒BmLectin10-pET32a和BmLectin11-pET32a轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，得到了BmLectin-10和BmLectin-11的重組蛋白。通過分析發(fā)

7、現(xiàn)重組蛋白存在于沉淀中，在尿素變性后利用帶鎳離子的純化填料進(jìn)行親和層析，獲得了可溶性的重組蛋白。
　　 綜上所述，本文對(duì)得到的兩個(gè)新型C型凝集素進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)BmLectin-10序列和含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的C型凝集素相似度很高，而BmLectin-11和含有一個(gè)結(jié)構(gòu)域的C型凝集素相似度很高，這說明BmLectin-10和BmLectin-11同屬于C型凝集素家族，但是在模式識(shí)別方面可能存在差異。注射不同的微生物后發(fā)現(xiàn)，BmLe