松江鱸(Trachidermus fasciatus)兩種C型凝集素的基因克隆、表達(dá)與功能分析.pdf

1、松江鱸（Trachidermus fasciatus）是一種降海洄游性魚類。歷史上松江鱸廣泛分布在我國沿海地區(qū)，但因近幾十年來各種環(huán)境污染嚴(yán)重，1988年已被列為國家Ⅱ級保護(hù)水生野生動(dòng)物。人工養(yǎng)殖成為恢復(fù)其自然種群的重要途徑，然而，面對養(yǎng)殖過程中日益頻發(fā)的病害問題，從松江鱸自身的免疫機(jī)制入手，尋求松江鱸疾病防治的有效手段成為當(dāng)務(wù)之急。C型凝集素是一類鈣依賴型糖結(jié)合蛋白，它們在先天免疫中作為模式識別受體發(fā)揮作用，并具有其他多種功能。為了更

2、深入的了解C型凝集素在松江鱸中的功能，我們對松江鱸兩種膜型C型凝集素進(jìn)行了表達(dá)與功能研究。利用EST和SMART技術(shù)克隆獲得基因的cDNA全長，利用熒光定量PCR技術(shù)分析其在mRNA水平上的組織分布和病原體刺激后免疫相關(guān)組織的表達(dá)模式;同時(shí)構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)獲得重組蛋白研究其蛋白活性，推測蛋白功能。
　　TfCD209的cDNA序列全長1042 bp，其中5'非編碼區(qū)(5' UTR)為256bp，有一個(gè)G的帽子結(jié)構(gòu);3'非編碼

3、區(qū)(3' UTR)為15 bp;開放閱讀框(ORF)為771bp，編碼256個(gè)氨基酸。蛋白序列預(yù)測蛋白分子量(MW)為29078.7，理論等電點(diǎn)(pD為5.45。結(jié)構(gòu)域預(yù)測，TfCD209分子包括一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)CTLD結(jié)構(gòu)域，在CTLD結(jié)構(gòu)域中有EPN甘露糖結(jié)合位點(diǎn)、WIGL保守序列和四個(gè)保守的半胱氨酸。二級結(jié)構(gòu)含有2個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊;Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹顯示，所有魚類的CD209聚為一大支，其他脊椎動(dòng)物

4、CD209聚為一支，符合進(jìn)化規(guī)律。qRT-PCR結(jié)果顯示TfCD209廣泛表達(dá)于松江鱸的各組織器官，但存在一定的組織差異性，其中在肝臟中的表達(dá)量最高。經(jīng)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后，松江鱸肝臟、鰓、皮膚和脾臟中的TfCD209在刺激后在不同的時(shí)間點(diǎn)都上調(diào)表達(dá)。TfCD209重組蛋白在不依賴鈣離子的情況下可以結(jié)合多種細(xì)菌。因此，推測TfCD209在松江鱸體內(nèi)可能做為模式識別受體參與機(jī)體免疫反應(yīng)。
　　TfCD

5、302的cDNA序列全長2195 bp，其中5'非編碼區(qū)(5'UTR)為62bp;3'非編碼區(qū)(3' UTR)為1448 bp;開放閱讀框(ORF)為735bp，編碼244個(gè)氨基酸。蛋白序列預(yù)測蛋白分子量(MW)為27165.8，理論等電點(diǎn)(pI)為4.69。SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測，其蛋白N端有信號肽，其后緊接著一個(gè)CTLD結(jié)構(gòu)域，C端有跨膜區(qū)。CTLD結(jié)構(gòu)域中不含有糖結(jié)合位點(diǎn)，四個(gè)保守的半胱氨酸依然保守。二級結(jié)構(gòu)含有2個(gè)α螺旋和5個(gè)β折

6、疊;Neighbor-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹顯示，松江鱸TfCD302與斑馬宮麗魚(Maylandiazebra)等魚類聚為一支，其他脊椎動(dòng)物CD302聚為一支，符合進(jìn)化規(guī)律。qRT-PCR結(jié)果顯示TfCD302廣泛表達(dá)于松江鱸的各組織器官，在頭腎中的表達(dá)量最高。經(jīng)鰻弧菌刺激后，在松江鱸肝臟、鰓、皮膚和脾臟中的TfCD302均上調(diào)表達(dá)。TfCD302重組蛋白在不依賴鈣離子的情況下可以結(jié)合多種細(xì)菌。因此，推測TfCD302在松江鱸體