松江鱸(Trachidermus fasciatus)抗氧化相關(guān)基因的克隆表達與功能分析.pdf

1、松江鱸是一種典型的降海洄游性魚類。歷史上，松江鱸分布范圍較廣。但是，隨著環(huán)境污染的加劇，松江鱸賴以生存和繁衍的生態(tài)環(huán)境遭到嚴重的破壞，現(xiàn)已被列入國家二級保護動物。人工養(yǎng)殖成為恢復(fù)其自然種群的重要途徑和手段，然而，松江鱸魚獨特的生物學(xué)和生理學(xué)特性，決定了它與其他魚類不同的病理、病癥特點。面對養(yǎng)殖過程中日益嚴重的病害問題，深入開展松江鱸免疫機制研究，并在此基礎(chǔ)上尋找松江鱸疾病防治的有效方法已成為當(dāng)務(wù)之急。研究表明，生物體在受到病原和重金屬等

2、刺激時，因氧化應(yīng)激體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)。ROS在殺滅入侵的病原微生物的同時，由于其反應(yīng)的非特異性，也會對宿主的細胞、組織和器官造成嚴重傷害，進而導(dǎo)致機體生理機能的損傷和免疫系統(tǒng)的破壞。所以，消除生物體內(nèi)因過度免疫反應(yīng)產(chǎn)生的過量ROS將能夠增強其抗病能力，有效地保護免疫器官和組織，抑制免疫細胞的凋亡，提高免疫力。
　　 硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)和過氧化物還原

3、酶(Peroxiredoxin，Prx)分別屬于生物體內(nèi)非酶抗和酶抗氧化劑，在清除ROS過程中發(fā)揮重要作用。本論文采用RACE(RapidamplificationofcDNAends)技術(shù)從松江鱸體內(nèi)克隆到了硫氧還蛋白1（TfTrx1）、硫氧還蛋白相關(guān)蛋白14(Thioredoxinrelatedprotein14，TfTRP14)和過氧化物還原酶1(TfPrx1)三種與免疫系統(tǒng)相關(guān)的抗氧化基因，分析了它們的分子結(jié)構(gòu)特征，采用實時熒光

4、定量PCR(QuantitativerealtimePCR，qRT-PCR)檢測了三個基因的組織分布及LPS和重金屬刺激后的表達模式變化;同時，將三個基因連接到pET-30a(+)載體，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的重組表達。獲得純化蛋白后，制各多克隆抗體，利用Westernblot檢測了LPS刺激后蛋白水平表達譜變化，并對蛋白活性進行了檢測。
　　 Trx是一種廣泛存在于生物體的具有氧化還原活性的酸性小分子蛋白質(zhì)。松江鱸Trx1（TfT

5、rx1）cDNA全長為665bp，包括5'端非編碼區(qū)39bp，3'端非編碼區(qū)290bp，開放閱讀框336bp，編碼111個氨基酸。TfTrx1預(yù)測分子量為12.34kD，理論等電點(pI)為4.52。TfTrx1不含信號肽，與裸蓋魚的同源性為66％，序列中含有高度保守的活性位點序列CGPC(Cys-Pro-Asp-Cys)。二級結(jié)構(gòu)含有5個β折疊和4個α螺旋，TfTrx1蛋白結(jié)構(gòu)與人類Trx1結(jié)構(gòu)非常吻合。通過Neighbor-join

6、ing方法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，松江鱸Trx與裸蓋魚等魚類Trx1首先聚在一起，然后與其他脊椎動物Trx1聚為區(qū)別于Trx2的一大支，從而也證明我們克隆到的是松江鱸Trx1基因。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，TfTrx1在血、心、肝臟、鰓、胃、腸、皮膚、肌肉、腎、脾、腦、卵均有表達。LPS刺激后皮膚、肝臟、脾、和腦中TfTrx1轉(zhuǎn)錄水平存在明顯的上調(diào)。在蛋白水平，皮膚和肝臟中，LPS刺激后TfTrx1的上調(diào)表達比mRNA水平的上調(diào)持續(xù)更長時間。

7、重金屬刺激組，在所有檢測的組織（皮膚、肝臟、脾、鰓和腦）中，TfTrx1均在刺激后24h上調(diào)至最高峰。為進一步探討其生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了TfTrx1重組質(zhì)粒，獲得了純化重組蛋白。熒光活性檢測發(fā)現(xiàn)，TfTrx1蛋白二硫鍵的還原能夠?qū)⑸彼岬臒晒鈴姸忍岣呓?.6倍，這暗示色氨酸殘基周圍微環(huán)境的變化。胰島素二硫鍵還原酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，TfTrx1蛋白在體外具有還原酶的活性，且活性具有一定的濃度依賴性。這說明TfTrx1在生理條件下，可作為一種

8、氧化還原酶，參與機體的免疫應(yīng)答過程。LPS作用實驗發(fā)現(xiàn)，TfTrx1可以與LPS直接結(jié)合發(fā)生相互作用。細菌結(jié)合和凝集實驗發(fā)現(xiàn)，TfTrx1可能通過與LPS的作用而導(dǎo)致其具有結(jié)合和凝集革蘭氏陰性菌的活性。這暗示TfTrx1可能在抵抗LPS對組織、器官損傷，促進吞噬細胞吞噬作用等機體免疫防御中發(fā)揮作用。
　　 TRP14是具有Trx樣活性中心的硫氧還蛋白超家族成員。松江鱸TRP14(TfTRP14)cDNA序列全長945bp，開放閱

9、讀框為372bp，編碼由123個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。蛋白的預(yù)測分子量為14.11kD，理論等電點(pI)為5.45，沒有信號肽。多序列比對結(jié)果顯示TRP14具有高度保守的活性位點序列CPDC(Cys-Pro-Asp-Cys)，TfTRP14與裸蓋魚序列同源性高達90％。二級結(jié)構(gòu)含有5個β折疊和4個α螺旋，TfTRP14蛋白結(jié)構(gòu)與人類TRP14結(jié)構(gòu)非常吻合。與TfTrx1相比，TfTRP14活性位點周圍包括一個延伸的α2-β2環(huán)和一個α3

10、a折疊區(qū)，這可能會導(dǎo)致兩種蛋白底物的特異性。實時熒光定量結(jié)果顯示，TfTRP14在各個組織均有表達，但是表達量高低具有組織特異性。LPS和重金屬刺激后，TfTRP14表達存在明顯上調(diào)，表明TfTRP14可能參與到松江鱸機體對微生物和重金屬的免疫防御中。為了驗證TfTRP14生物學(xué)活性，利用原核表達系統(tǒng)獲得TfTRP14重組蛋白，活性二硫鍵的還原能夠顯著的提高色氨酸殘基的熒光強度，但是胰島素二硫鍵還原酶活性顯著的低于TfTrx1，可能由于

11、TfTRP14與TfTrx1具有不同的氧化還原特點，因而使底物具有一定的差異性所致。
　　 由于絕大部分過氧化物還原酶在體內(nèi)以硫氧還蛋白作為惟一的氫供體，因此又被稱為硫氧還蛋白過氧化物酶。松江鱸Prx1(TfPrx1)的cDNA序列全長1047bp，開放閱讀框為600bp，編碼199個氨基酸。TfPrx1預(yù)測分子量為22.35kD，理論等電點為6.42。多序列比對發(fā)現(xiàn)，TfPrx1含有Prx特征肽段“FYPLDFTFVCPTEI

12、”和“GEVCPA”，屬于典型的2-Cys型Prx。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示松江鱸Prx與其他物種的Prx1聚在一起，區(qū)別于Prx2分支，這證明我們克隆到的是松江鱸Prx1基因。TfPrx1在檢測的各個組織中都有表達，其中以腸中表達最強，其次為腦，而在肝臟和肌肉中的表達較弱。LPS和重金屬刺激后，TfPrx1在主要免疫器官和腦中均明顯上調(diào)表達，表明TfPrx1可能在抗氧化應(yīng)激相關(guān)的機體免疫中發(fā)揮重要作用。該基因的原核重組表達蛋白在DTT存在的條件