灰葡萄孢除草相關(guān)基因的克隆與功能分析.pdf

1、本實驗室利用mRNA差異顯示技術(shù)對灰葡萄孢野生菌株BC4和部分誘變菌株(強(qiáng)除草活性菌株和弱除草活性菌株)進(jìn)行分析，得到一個694 bp的基因片段，該基因可能調(diào)控灰葡萄孢除草活性，本研究利用Genomic Walking技術(shù)對該基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過兩次5’端Genomic Walking和兩次3’端Genomic Walking，將該基因片段694 bp擴(kuò)增到3961 bp，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對表明，該基因與富克葡萄孢盤菌(

2、Botryotinia　fuckeliana，灰葡萄孢的有性態(tài))中的calcium/calmodulin dependent proteinkinase(CaMK)同源性98％。根據(jù)GenBank報道Botryotinia fuckeliana的完整CDS，從兩端設(shè)計引物，利用RT-PCR技術(shù),克隆了BC4的cDNA全長。Southern雜交結(jié)果表明該基因在基因組中以單拷貝形式存在。 對CaMK基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用DNA

3、MAN軟件將CaMK基因cDNA序列與DNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)BC4菌株的CaMK基因含有7個外顯子和6個內(nèi)含子。利用DNAStar軟件對CaMK蛋白性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測表明，CaMK預(yù)測蛋白的分子量為81.8748 kD，共有730個氨基酸，包括95個強(qiáng)堿性氨基酸(K，R)，116個強(qiáng)酸性氨基酸(D，E)，216個疏水氨基酸(AlLFWV)，160個極性氨基酸(NCQSTY)，等電點(Isoelectric Point)為6.22。利用Sca

4、nPro site軟件分析CaMK一級結(jié)構(gòu)中包含的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)CaMK基因一級結(jié)構(gòu)中包含蛋白激酶ATP結(jié)合位點和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點。利用SOPMA軟件分析CaMK蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEl軟件構(gòu)建CaMK蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。用已獲得的灰葡萄孢CaMK基因5’端開放閱讀框前1330 bp基因組DNA序列在softberry網(wǎng)站中進(jìn)行啟動子可能功能分析。 構(gòu)建了重組CaMK質(zhì)粒，并成功地在Eco

5、li BL2l中得到表達(dá)。結(jié)果顯示重組的CaMK蛋白大量表達(dá)在沉淀中，在上清中沒有表達(dá)。研究的結(jié)果為蛋白純化和蛋白抗體制備以及進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。 用CaMK特異性抑制劑KN-62處理灰葡萄孢孢子，結(jié)果表明，60μM的KN-62對灰葡萄孢孢子萌發(fā)抑制率為50％，80 μM的KN-62對孢子萌發(fā)抑制率可達(dá)98％以上；灰葡萄孢用80μM的KN-62處理后對番茄致病性明顯降低，用80μM KN-62處理后所產(chǎn)毒素的除草活