灰葡萄孢鈣調(diào)磷酸酶基因β亞基及其啟動子的克隆與序列分析.pdf

1、植物病原真菌的生長、發(fā)育和致病性均受到真菌的細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控。如:Ca2+途徑、cAMP途徑和MAPK途徑。CNB基因通過去磷酸化作用可對其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行調(diào)節(jié)，本論文克隆了CNB基因及其5'上游調(diào)控序列，并對其進行了生物信息學(xué)分析、拷貝數(shù)的驗證，構(gòu)建了CNB基因正反義表達載體，為進一步明確CNB基因與灰葡萄孢病菌的致病性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 本試驗根據(jù)CNB基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，以番茄灰霉病菌BC1菌株的c

2、DNA為模板，通過PCR技術(shù)獲得CNB基因的部分片段，通過NCBI的同源性分析，在灰葡萄孢EST表達序列標簽庫中發(fā)現(xiàn)兩條與該片段同源性達到100％的EST標簽，通過DNAMAN軟件分析，拼接獲得了CNB基因525bp的cDNA開放閱讀框(ORF)。然后根據(jù)CNB基因cDNA全長序列設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，以番茄灰霉病菌BC1基因組DNA為模板，擴增獲得了該基因810bp的DNA全長序列。利用DNAMAN軟件對DNA序列和cDNA序

3、列進行對比分析，發(fā)現(xiàn)CNB基因cDNA開放閱讀框編碼174個氨基酸，DNA序列含有3個大小分別為40bp、120bp和84bp的內(nèi)含子，在內(nèi)含子的邊緣都顯示出典型的內(nèi)含子邊緣特征序列“GT…AG”。 利用NCBI對CNB蛋白進行分析，結(jié)果表明CNB蛋白含有4個EF手型Ca2+結(jié)合區(qū)域，相對分子量為19.7498.KD，等電點為4.28，其中含有32個帶負電荷的氨基酸，21個帶正電荷的氨基酸，不含有半胱氨酰、組氨酸和色氨酸，在進行

4、蛋白純化時應(yīng)該選擇弱陽離子介質(zhì)進行離子交換色譜。利用Genome walking技術(shù)獲得了CNB基因5'上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，通過Softberry軟件進行同源性分析，結(jié)果表明該序列中具有1個重要的核轉(zhuǎn)錄因子NF-Kb結(jié)合位點，1個激活蛋白質(zhì)AP-2結(jié)合位點，以及Sp1、E2F、BKLF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點各1個，該啟動子具有如此多的轉(zhuǎn)錄因子位點，而這些作用元件大多與細胞增殖有關(guān)，這否與灰霉的強致病性有關(guān)，還需要進一步的研究證明的。 以