小麥鈣調(diào)磷酸酶B亞基類蛋白(CBL)的基因克隆及TaCBL1的功能研究.pdf

1、小麥?zhǔn)侨驈V泛種植的主要農(nóng)作物之一，各種自然災(zāi)害，如旱、澇、鹽堿等環(huán)境的急劇變化以及病蟲害,導(dǎo)致小麥大量減產(chǎn)。因此，提高抗逆性對(duì)于保證小麥產(chǎn)量具有非常積極的意義。
　　在植物中，很多外界環(huán)境的刺激都會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化，從而傳遞外界信息進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而引起各種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間發(fā)生響應(yīng)的生理生化反應(yīng)，調(diào)整自身適應(yīng)外界壞境以求在嚴(yán)苛的自然環(huán)境中生存下來。作為鈣離子信號(hào)的感受器，鈣離子結(jié)合蛋白家族在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗逆過程中發(fā)揮重要

2、作用。目前，植物中已發(fā)現(xiàn)的鈣離子結(jié)合蛋白主要有三大類：鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)類蛋白、鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)以及鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)。
　　本文旨在獲得小麥CBL基因序列，檢測(cè)其表達(dá)特性及亞細(xì)胞定位，以了解小麥CBL基因在抗逆中的作用，并對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步研究CBL的功能，為最終

3、培育高抗性小麥奠定基礎(chǔ)。本文主要獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　(1)利用生物信息技術(shù)，將從數(shù)據(jù)庫中獲取的小麥CBL相關(guān)EST序列進(jìn)行拼接,得到11條CBL基因序列(unigenes)；利用分子生物學(xué)手段成功獲得其中三個(gè)包含完整ORF(Open Reading Frame)的CBL基因cDNA，所獲得的基因所編碼的蛋白質(zhì)分別與水稻的CBL1、CBL3和CBL6高度同源，因此對(duì)應(yīng)的基因被命名為TaCBL1、TaCBL3和TaCBL6。

4、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析也發(fā)現(xiàn)，小麥中的CBL蛋白與擬南芥、水稻、楊樹、玉米等植物中相應(yīng)的CBL蛋白結(jié)構(gòu)極其相似。
　　(2)通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR)技術(shù)，分析小麥多個(gè)部位的多個(gè)發(fā)育階段中TaCBL1、TaCBL3和TaCBL6的基因表達(dá)情況，并檢測(cè)了小麥幼苗在模擬的低溫、干旱、高鹽脅迫及外源脫落酸(abscisic acid,ABA)刺激下的基因表達(dá)變化。實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果顯示，一個(gè)TaCBL基因可以響應(yīng)多種逆境，而一種逆境信號(hào)可以引起多個(gè)TaCBL基因的響應(yīng)。
　　(3)分別構(gòu)建了TaCBL1-GFP、TaCBL3-GFP和TaCBL6-GFP融合蛋白的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在細(xì)胞膜上均觀察到了TaCBL1、TaCBL3和TaCBL6的GFP融合蛋白。
　　(4)構(gòu)建了pBI-TaCBL1載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum L.cv.S

6、amsun)。通過對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗逆分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TaCBL1可以提高煙草植株的抗旱性。轉(zhuǎn)基因煙草植株的水含量提高，細(xì)胞損傷減輕，并且抗氧化能力增強(qiáng)。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了小麥TaCBL1、TaCBL3、TaCBL6蛋白具有CBL蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)特征，參與了小麥對(duì)于逆境信號(hào)的響應(yīng)；過表達(dá)TaCBL1基因可以通過增加植物抗氧化能力抵御細(xì)胞損傷，從而提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)于干旱環(huán)境的適應(yīng)能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究和了解CBL基