小麥類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白TaCBL4和TaCBL3的功能研究.pdf

1、非生物逆境是作物產(chǎn)量的主要制約因素?，F(xiàn)代分子生物學(xué)手段現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于育種研究，并獲得不少具有優(yōu)良耐逆能力的作物新品種。類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(calcineurin B-like proteins，CBL)是一類重要的鈣信號(hào)受體蛋白，在非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中具有重要作用，主要通過與CBL相互作用蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases，CIPK)相互作用將信號(hào)向下游傳遞。擬南芥中CBL和CIPK家族成員在耐

2、逆中的作用已有較深入的研究，其中AtSOS3(CBL4)和AtCIPK24(SOS2)是SOS途徑的兩個(gè)關(guān)鍵組分，在植物鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。但是小麥中CBL和CIPK家族成員功能以及是否存在SOS途徑還不清楚，SOS途徑在植物中是否具有保守性和通用性還未見報(bào)道。
　　 本研究基于以上科學(xué)問題，利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析了小麥CBL和CIPK基因家族，從本室培育的小麥漸滲系耐鹽品種山融3號(hào)(SR3)中克隆了一系列TaCBLs

3、和TaCIPKs基因，并初步驗(yàn)證了TaCBL4、TaCBL3在非生物脅迫應(yīng)答中的功能。
　　 一、小麥CBL和CIPK的生物信息學(xué)分析和新基因克隆
　　 通過生物信息學(xué)分析，電子克隆了14個(gè)小麥CBL家族成員和34個(gè)小麥CIPK家族成員。多序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析顯示，這些TaCBLs在大小和結(jié)構(gòu)上非常保守，其中5個(gè)具有豆蔻?；稽c(diǎn)，2個(gè)具有跨膜疏水區(qū)，暗示這7個(gè)TaCBLs在抗逆中發(fā)揮重要作用。TaCIPKs間序列差異比較

4、大，但結(jié)構(gòu)十分保守。SR3中TaCIPKs間也存在差異，這可能與基因倍增過程相關(guān)。進(jìn)化樹分析顯示，小麥中TaCBLs和TaCIPKs都存在許多旁系同源基因，并且它們與水稻中同源基因的相似性高于擬南芥。
　　 將這些電子克隆的TaCIPK基因與實(shí)驗(yàn)室定制的小麥cDNA芯片探針進(jìn)行比對(duì)，以分析它們的鹽脅迫應(yīng)答特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8個(gè)TaCIPKs在芯片中有特異性匹配探針，其中4個(gè)為鹽誘導(dǎo)表達(dá)基因，4個(gè)鹽下調(diào)表達(dá)基因;另外，芯片中有3個(gè)探

5、針分別對(duì)應(yīng)多個(gè)TaCIPK序列，而且這3個(gè)探針在鹽脅迫24 h后表達(dá)量都顯著提高。這些鹽脅迫應(yīng)答的TaCIPKs可能都參與植物的鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)，其功能需要進(jìn)一步研究。
　　 根據(jù)電子克隆序列，從SR3中克隆3個(gè)TaCBL和9個(gè)TaCIPK新基因，按照與擬南芥 CBLs的同源性，分別命名為 TaCBL1/3/4和TaCIPK2/8/11/15/17/19/30/32/34。TaCIPKs中，TaCIPK8、TaCIPK15在鹽脅迫

6、下上調(diào)表達(dá)，TaCIPK11下調(diào)表達(dá)，其他基因的應(yīng)答模式有待進(jìn)一步驗(yàn)證，為耐鹽候選基因的鑒定及TaCBL互作蛋白的篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、小麥TaCBL4和TaCBL3功能分析
　　 1、 TaCBL4結(jié)構(gòu)與可能作用分析
　　 TaCBL4有7個(gè)內(nèi)含子，其編碼產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜，與擬南芥同源基因AtSOS3（CBL4）相似，是AtSOS3同源基因。TaCBL4在小麥的根、葉、莖、幼穗、麥芒、幼胚、旗葉等組織中均

7、能表達(dá)，NaCl脅迫下其表達(dá)量明顯增加，表明TaCBL4在小麥生長(zhǎng)發(fā)育和鹽脅迫應(yīng)答過程中均發(fā)揮重要作用。
　　 為了驗(yàn)證TaCBL4的生物學(xué)功能及其與AtSOS3的異同，將其在擬南芥Col-0野生型和sos3突變體中異源表達(dá)，觀察表型變化，并用AtSOS3在擬南芥中的過表達(dá)系作為對(duì)照。TaCBL4過表達(dá)不影響擬南芥的營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)。在1/2 MS培養(yǎng)基中，Col-0(WT)、TaCBL4過表達(dá)野生型系(OE)、TaCBL4過表達(dá)

8、sos3(sOE)幼苗根長(zhǎng)和地上部分無顯著性差異。NaCl脅迫下，與WT相比，sos3幼苗的主根更短、地上部分漂白程度高，與朱建康實(shí)驗(yàn)室結(jié)果一致;而OE系和sOE系幼苗根與WT沒有顯著差別，但是葉片顯著變小。這顯示，TaCBL4能夠恢復(fù)sos3根的表型，但首次發(fā)現(xiàn)OE系和sOE系在脅迫下抑制葉生長(zhǎng)。LiCl脅迫下，與WT相比，sos3幼苗的主根明顯變短、地上部分變小，而OE系、sOE系及AtSOS3過表達(dá)系幼苗正好相反，主根更長(zhǎng)、地上部

9、分更大，首次表明TaCBL4和AtSOS3過表達(dá)可以提高幼苗期鋰離子脅迫抗性。在ABA處理和滲透脅迫下，不同株系無明顯差異，表明TaCBL4是一個(gè)離子特異性響應(yīng)基因。
　　 相比植株發(fā)育，鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響更大。為了分析TaCBL4在這一階段是否發(fā)揮重要作用，我們以綠色子葉張開率為標(biāo)準(zhǔn)，比較了不同株系在鈉、鋰離子脅迫下的萌發(fā)率差異。NaCl脅迫下，sos3不萌發(fā)，WT萌發(fā)率降低，而OE系和sOE萌發(fā)率受影響少，萌發(fā)率明顯比W

10、T高。LiCl處理下，WT和sos3的萌發(fā)率降低，其中sos3降低更明顯，而OE系和sOE萌發(fā)率無顯著變化。
　　 高鹽土壤一般堿性較高，我們發(fā)現(xiàn)與WT相比，OE系在鹽堿條件下的萌發(fā)率明顯提高。
　　 以上結(jié)果顯示，TaCBL4和AtSOS3一樣，也是鈉、鋰離子特異性響應(yīng)基因，并且TaCBL4和AtSOS3在鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮相似的功能，表明小麥中也存在SOS系統(tǒng)，而且不同植物間SOS系統(tǒng)存在保守性和通用性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，T

11、aCBL4在小麥抗鈉離子育種中應(yīng)該有針對(duì)性地設(shè)計(jì)在種子萌發(fā)階段特異性表達(dá)，而在抗鋰離子育種中則不受此限制。
　　 有趣的是，低鉀條件下，與Col-0相比，OE系和sOE系幼苗的地上部分明顯變小，而AtSOS3過表達(dá)系則無顯著變化，推測(cè)TaCBL4可能還調(diào)控鉀離子通道的活性。這一結(jié)果表明，TaCBL4在鹽脅迫應(yīng)答中的作用與鉀相關(guān)，幼苗階段TaCBL4降低對(duì)Na+的耐性是由于負(fù)調(diào)控K+的轉(zhuǎn)運(yùn)引起的，顯示了不同物種間SOS系統(tǒng)的特異性

12、。
　　 為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)TaCBL4的作用機(jī)制及其與AtSOS3功能的異同，我們利用酵母雙雜交方法分離擬南芥中與TaCBL4相互作用的CIPK蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaCBL4能與AtCIPK5/10/11/15/18/21/24這7個(gè)CIPKs互作，其中AtCIPK15/24為AtSOS3互作蛋白，而AtCIPK6/7不與TaCBL4互作。推測(cè)TaCBL4通過與AtCIPK11相互作用而抑制了后者活性，提高了植株的抗鹽堿性，通過At

13、CIPK24(SOS2)互作而激活SOS通路促進(jìn)Na+外排。TaCBL4和AtSOS3互作CIPKs種類存在相似性和特異性，而且TaCBL4和AtSOS3對(duì)與其共同互作的CIPKs的調(diào)控也可能存在差異性，那么這種特異性和差異性是否與TaCBL4過表達(dá)導(dǎo)致的低鉀敏感型相關(guān)，需要進(jìn)一步研究。
　　 2、 TaCBL3功能的初步分析
　　 TaCBL3與水稻OsCBL6及擬南芥AtCBL2、AtCBL6相似性較高，其編碼蛋白定

14、位于液泡膜。離子和滲透脅迫下，TaCBL3過表達(dá)擬南芥株系與Col-0無明顯差異。缺鉀誘導(dǎo)TaCBL3的表達(dá)，而且缺鉀條件下，與Col-0相比，TaCBL3過表達(dá)株系黃化更嚴(yán)重，植株生長(zhǎng)抑制程度更顯著。這表明，TaCB(L)3可能是鉀離子通道的抑制因子，為植物離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究提供了新的基因資源。
　　 總之，本論文通過生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法，系統(tǒng)分析了小麥CBL和CIPK家族成員的序列和表達(dá)特征，通過CBL4的功能分析明確了