玉米抗氧化相關(guān)基因Zm-APX的克隆及功能分析.pdf

1、玉米（Zea mays L.）作為重要的飼料作物、糧食作物及工業(yè)原料，對糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展均有重要意義。玉米在生長周期中會遇到各種生物（病毒、昆蟲等）和非生物（干旱、高溫、鹽害等）脅迫，會對玉米的生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響，導(dǎo)致玉米產(chǎn)量降低，甚至絕收。玉米雖不能像動物那樣通過移動自身位置或通過體內(nèi)的巨噬細(xì)胞來躲避外界傷害，但玉米有其特有的防御機(jī)制，如何發(fā)掘并分離防御反應(yīng)中的重要蛋白質(zhì)，同時在體外對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分析及功能驗證，對探討玉米防御反

2、應(yīng)途徑具有重要的理論和實踐意義。本研究以基因組已測序的玉米自交系B73為實驗材料，在甘蔗花葉病毒（SCMV）侵染抗性品種四一和易感品種B73蛋白組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對其中一個差異表達(dá)的重要蛋白抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）進(jìn)行研究，其主要研究結(jié)果如下：
　　1、利用同源克隆技術(shù)，克隆了玉米的Zm-APX基因。克隆得到一段1186bp的cDAN序列，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，Zm-APX的cDAN包含一個

3、750bp的編碼框；其中ORF編碼250個氨基酸，編碼蛋白預(yù)測的分子量為27.4kD，等電點PI為5.64；該段ORF與其相對應(yīng)的DNA序列比對分析發(fā)現(xiàn)：Zm-APX的DNA序列具有9個外顯子，8個內(nèi)含子；玉米APX蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，暗示該蛋白可能屬于胞內(nèi)蛋白質(zhì)，定位在細(xì)胞質(zhì)中；不同物種APX同源比對結(jié)果表明，Zm-APX與高粱APX蛋白親緣關(guān)系最近，其次是谷子,和水稻、棉花等的APX蛋白親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)；同時Zm-APX基

4、因在玉米各個組織中均有表達(dá)。
　　2、對玉米B73幼苗進(jìn)行非生物（干旱、高溫、高鹽、激素）脅迫處理，利用實時熒光PCR(RT-PCR)技術(shù)初步研究了Zm-APX基因的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，在高溫（370C）處理下，Zm-APX相對表達(dá)量迅速升高，在處理3h后達(dá)到最大值，之后雖有所下降，但仍維持在對照以上水平；在干旱處理保證玉米正常生理狀態(tài)下，隨干旱程度的加劇，Zm-APX相對表達(dá)量不斷增加；在鹽（350mM NaCl）處理下，Zm-

5、APX相對表達(dá)量在處理12h后達(dá)到峰值，為對照的3倍左右；在激素（ABA、SA）處理下，兩者表達(dá)規(guī)律不同，ABA處理時，Zm-APX相對表達(dá)量始終維持在對照的3倍左右，SA處理下，Zm-APX相對表達(dá)量呈現(xiàn)出先增后降的規(guī)律，綜合以上可以推測，Zm-APX與玉米抵抗非生物脅迫密切相關(guān)。
　　3、構(gòu)建熒光表達(dá)載體pCAMBIA1304-Zm-APX，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)實驗，在共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)分布情況，證實Zm

6、-APX蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。構(gòu)建過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Zm-APX，通過花絮侵染法轉(zhuǎn)染擬南芥，篩選出穩(wěn)定遺傳的擬南芥植株。在非生物脅迫（干旱、高溫和高鹽）處理下，轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-Zm-APX擬南芥與轉(zhuǎn)pCAMBIA3301空載擬南芥及野生型擬南芥相比，干旱一周后，三種基因型擬南芥均出現(xiàn)萎焉死亡現(xiàn)象，但存活率分別為32％、5%和1%，復(fù)水一周后存活率分別為為80%、8%和3%；高溫處理一周后，存活率分別為75%、25

7、%和25%；高鹽處理一周后，存活率分別為78%、12%和11%，此結(jié)果暗示，Zm-APX基因在增強(qiáng)擬南芥抗非生物脅迫中確實具有積極的調(diào)節(jié)作用，但對干旱和高鹽具有更強(qiáng)的抵抗能力，這可能與APX同工酶的特異性作用有關(guān)。在非生物脅迫（干旱、高溫和高鹽）處理下，過表達(dá)Zm-APX基因的擬南芥體內(nèi)ABA1和ABA2表達(dá)量明顯上升，ABA1和ABA2基因是調(diào)控植物激素ABA合成的上游關(guān)鍵基因，說明Zm-APX在增強(qiáng)擬南芥的抗性方面與ABA的合成密切