分蘗洋蔥化感相關(guān)基因的克隆及功能分析.pdf

1、隨著設(shè)施栽培面積不斷擴(kuò)大，連作現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，也成為了亟待解決的問(wèn)題，而采用合理的輪、間、套作是解決蔬菜連作障礙的有效途徑。本課題組多年的研究發(fā)現(xiàn)，設(shè)施栽培分蘗洋蔥伴生番茄后，能有效地減輕番茄病害的發(fā)生，促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)，產(chǎn)量增加5～8％。目前已有很多分蘗洋蔥的化感作用分子機(jī)理的研究報(bào)道，而基因?qū)Ψ痔Y洋蔥化感作用的調(diào)控還尚不清楚。
　　本研究以分蘗洋蔥、番茄為試材，利用課題組前期通過(guò)的RNA-Seq高通量測(cè)序、表達(dá)譜DGE結(jié)果確

2、定的與分蘗洋蔥化感作用相關(guān)的兩個(gè)基因Chi、Pal，采用分子克隆的方法進(jìn)行3' RACE擴(kuò)增，首次從分蘗洋蔥中克隆得到AcadChi、AcadPal基因全長(zhǎng)，構(gòu)建了超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中。研究驗(yàn)證基因相關(guān)功能，應(yīng)用qRT-PCR、PCR-DGGE、Illumian Miseq測(cè)序技術(shù)等研究其對(duì)根區(qū)微生物群落分布及豐度、多樣性的影響，驗(yàn)證了擬南芥根系分泌物對(duì)番茄的化感效應(yīng)及對(duì)番茄黃萎病菌抑菌效應(yīng)。旨在為揭示分蘗洋蔥伴生番茄機(jī)理的研究提供

3、理論依據(jù)，對(duì)研究分蘗洋蔥化感作用及其在設(shè)施栽培的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。本研究的主要結(jié)論如下:
　　1.采用熒光定量PCR驗(yàn)證化感潛力強(qiáng)、弱的分蘗洋蔥材料根系中的差異基因，發(fā)現(xiàn)Chi、Pal兩個(gè)基因隨著取樣時(shí)間的變化，相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)降低-升高-降低的趨勢(shì)，基因表達(dá)趨勢(shì)與田間試驗(yàn)基本一致。因此，確定Chi、Pal兩個(gè)基因作為主要的研究對(duì)象。
　　2.通過(guò)RACE-PCR和RT-PCR的方法克隆得到Chi、Pal基因。分蘗洋蔥

4、的AcadChi基因，開(kāi)放閱讀框?yàn)?33 bp，編碼210個(gè)蛋白。而AcadPal開(kāi)放閱讀框?yàn)?124 bp，編碼708個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。成功建立了Chi、Pal基因的超表達(dá)載體pCAMBIA1301-Chi（Pal）。
　　3.Chi基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了擬南芥開(kāi)花，具有促進(jìn)植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的作用，對(duì)于葉片、抽薹的形成都具有明顯的調(diào)控作用;Pal在擬南芥中過(guò)表達(dá)同樣促進(jìn)了擬南芥開(kāi)花，同時(shí)影響了葉色的變化。
　　4.

5、Chi、Pal基因的過(guò)表達(dá)，能夠促進(jìn)擬南芥葉片、根中類(lèi)黃酮的有效積累，類(lèi)黃酮含量顯著增加(p＜0.05），說(shuō)明Chi、Pal基因是在類(lèi)黃酮合成途徑中起作用的基因。Pal的過(guò)表達(dá)到擬南芥，轉(zhuǎn)Pal基因擬南芥葉片總?cè)~綠素含量要顯著高于野生型和Pal突變體(p＜0.05)，表明基因在擬南芥中得到了有效表達(dá)。探討了Chi、Pal基因在擬南芥體內(nèi)的表達(dá)模式，轉(zhuǎn)AcadChi、AcadPal基因擬南芥各組織的的表達(dá)量均高于野生型擬南芥，其表達(dá)量均為

6、葉＞莖＞根。
　　5.DGGE和qPCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Chi、Pal基因影響了擬南芥根區(qū)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和群落豐度。轉(zhuǎn)Chi、野生型與突變體擬南芥相比，顯著提高了土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)(p＜0.05），顯著降低了真菌均勻度指數(shù)(p＜0.05）。轉(zhuǎn)Chi基因、野生型擬南芥土壤細(xì)菌16S rDNA基因群落豐度顯著高于突變體(p＜0.05），真菌群落豐度相對(duì)突變體顯著下降(p＜0.05)。轉(zhuǎn)Pal擬南芥土壤細(xì)菌群落豐度顯著高于突

7、變體(p＜0.05）。
　　6.通過(guò)Illumian Miseq高通量測(cè)序結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Chi、Pal基因擬南芥改變了土壤細(xì)菌群落豐度、多樣性指數(shù)和組成。轉(zhuǎn)Chi、Pal基因提高了細(xì)菌豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)。轉(zhuǎn)Chi基因處理增加了藍(lán)藻菌門(mén)、芽孢桿菌門(mén)、γ-變形菌綱、藍(lán)藻菌綱的相對(duì)百分豐度。轉(zhuǎn)Pal基因增加了變形菌門(mén)、α-變形菌綱、的δ-變形菌綱、厭氧繩菌綱的相對(duì)百分豐度。主成分分析(PCoA)和坐標(biāo)軸(PCA)圖分析表明，不同擬南芥

8、的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同。轉(zhuǎn)Chi、Pal基因擬南芥與野生型、突變體擬南芥相比細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均有較大差異;三者距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，轉(zhuǎn)基因改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)進(jìn)化分支圖(LEfSe)的分析，確定了擬南芥顯著性差異的類(lèi)群，轉(zhuǎn)Chi基因擬南芥土壤中主要的微生物類(lèi)群為藍(lán)藻門(mén)、黃色單孢菌目（科）、紅桿菌且（科）等。轉(zhuǎn)Pal基因擬南芥土壤中主要的的微生物類(lèi)群為綠彎菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、α-變形菌綱、γ-變形菌綱、厭氧繩菌綱（目）、

9、粘球菌目、紅螺菌科等。
　　7.不同擬南芥根系分泌物對(duì)番茄種子發(fā)芽均有促進(jìn)作用，轉(zhuǎn)Chi、Pal的擬南芥根系分泌物顯著促進(jìn)胚根伸長(zhǎng)和全株干、鮮重(p＜0.05）。擬南芥根系分泌物對(duì)番茄黃萎病菌有顯著的抑制作用(p＜0.05）。轉(zhuǎn)Pal基因處理菌落顯著小于其它各處理(p＜0.05）。轉(zhuǎn)Chi、Pal基因的抑菌率高于野生和突變體。
　　綜上結(jié)果表明:本文驗(yàn)證了分蘗洋蔥/番茄伴生中得到的Chi、Pal基因的功能。轉(zhuǎn)Chi、Pal基