玉米大斑病菌StKU80基因的克隆及功能分析.pdf

1、分類號(hào)：密級(jí)：$435131單位代碼：學(xué)號(hào)：1008620132050049玉米大斑病菌StKU80基因的克隆及功能分析CloningandFunctionAnalysisofStKU80GeneinSetosphaeriaturcica學(xué)位申請(qǐng)人：楊曉榮指導(dǎo)教師：谷守芹教授董金皋教授學(xué)科專業(yè)：植物學(xué)學(xué)位類別：理學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一六年五月三十日摘要本課題組前期利用基因敲除技術(shù)獲得了10余個(gè)玉米大斑病菌基因敲除突

2、變體，并明確了其功能。但研究過程中發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌靶基因敲除效率極低，這已成為制約病菌基因功能研究的瓶頸。文獻(xiàn)報(bào)道，非同源末端連接(NHEJ)是造成靶基因敲除效率較低的主要原因，敲除NHEJ密切相關(guān)的基因可以顯著提高靶基因敲除的效率?；诖?，本研究擬在克隆玉米大斑病菌中與NHEJ密切相關(guān)的基因StKU80(DNA末端結(jié)合蛋白)的基礎(chǔ)上，利用基因敲除技術(shù)獲得該基因的敲除突變體，并通過分析突變體與野生型菌株表型及致病方面等的差異，明確該基

3、因的功能，最終分析該基因敲除突變體是否可作為靶基因敲除受體。主要研究結(jié)果如下：(1)克隆得到了玉米大斑病菌StKU80基因，該基因的DNA全長(zhǎng)為2439bp，cDNA為2199bp，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子；對(duì)該基因編碼蛋白質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，StKU80p包含KU70p／KU80p蛋白所特有的保守結(jié)構(gòu)域(vWa、Ku78和KuPKbind)。(2)獲得了StKU80基因敲除突變體。以pBS載體為基本骨架、草胺磷抗性基因(蒯尺)作為篩選標(biāo)記，

4、成功構(gòu)建了StKU80基因敲除載體；利用PEG4000介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌野生型菌株0123，通過草胺磷抗性篩選及抗性引物PCR、特異引物PCR、RTPCR、Southemblotting驗(yàn)證，最終獲得2株StKU80基因敲除突變體，分別命名為△StKU801、AStKU802。(3)與野生型菌株相比，突變體AStKU801、△StKU802的菌落顏色形態(tài)均發(fā)生明顯變化，菌絲形態(tài)與細(xì)胞壁也均出現(xiàn)顯著差異。突變體菌落正面呈

5、淺灰色，背面灰褐色，氣生菌絲細(xì)長(zhǎng)、平伏、稀疏，菌落邊緣不規(guī)則，但菌落生長(zhǎng)速率與野生型無明顯差異；光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體菌絲細(xì)胞較野生型變長(zhǎng)，但菌絲細(xì)胞直徑?jīng)]有明顯差異；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變體菌絲細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞表面的分泌物減少，細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量增多；突變體不產(chǎn)生分生孢子。表明StKU80基因參與了病菌菌絲及分生孢子的發(fā)育。(4)菌絲穿透試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型菌絲可穿透玻璃紙，而突變體△StKU801、AStKU802的菌絲均不能穿透玻璃

6、紙；在60h時(shí)，突變體AStKU801、△StKU802菌絲仍不能形成成熟的附著胞，而野生型在24h時(shí)即可觀察到成熟的附著胞；毒素活性分析發(fā)現(xiàn)，突變體的HT粗毒素活性與野生型的相比沒有明顯變化。結(jié)果表明StKU80參與調(diào)控病菌的附著胞發(fā)育，但對(duì)HT毒素毒力沒有影響。(5)本研究發(fā)現(xiàn)，突變體AStKU801、aStKU802對(duì)氧脅迫高度敏感，但對(duì)紫外輻射反應(yīng)不敏感。表明StKU80正調(diào)控病菌的氧脅迫反應(yīng)，而不參與對(duì)紫外輻射的反應(yīng)。基于上述