玉米大斑病菌StLAC4、StLAC6漆酶基因表達(dá)和功能分析.pdf

1、漆酶是一種多銅氧化酶，不僅在真菌的生活史中發(fā)揮重要作用，同時(shí)在真菌黑色素代謝、致病性以及工業(yè)應(yīng)用中具有較高的研究?jī)r(jià)值。為明確漆酶同工酶基因在玉米大斑病菌中的生物學(xué)作用，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了該病菌在不同木質(zhì)素分解產(chǎn)物存在下不同漆酶基因的表達(dá)規(guī)律;通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析病菌中歸類為典型子囊菌漆酶StLAC4和StLAC6基因結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)，分別純化得到了其純品重組漆酶Stlac4和Stlac6，經(jīng)檢測(cè)，Stlac4

2、和Stlac6均具有漆酶活性;根據(jù)同源重組的原理構(gòu)建了StLAC4和StLAC6基因敲除載體，利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得了StLAC4基因缺失突變體，并初步分析其在病菌中的作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確漆酶同工酶基因StLAC4和StLAC6在玉米大斑病菌致病過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了玉米大斑病菌2個(gè)漆酶基因在木質(zhì)素分解產(chǎn)物存在下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在加入香草酸時(shí)StLAC4和St

3、LAC6的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，其中StLAC4的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的4.9±1.4倍;當(dāng)添加4-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲醛時(shí)，StLAC4的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，分別為CK的4.6±0.9倍和3.1±0.5倍。
　　2.利用生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Stlac4和Stlac6具有漆酶典型的三個(gè)多銅氧化酶銅離子結(jié)合位點(diǎn)及催化結(jié)構(gòu)域;預(yù)測(cè)Stlac4和Stlac6蛋白分子量分別為65.94kDa和65.86kDa，等電點(diǎn)為7.16和5.07，

4、總體疏水性(GRAVY)為-0.350和-0.296，表明其為親水蛋白。
　　3.構(gòu)建了pET-Stlac4和pET-Stlac6兩個(gè)蛋白表達(dá)載體，并以E.coli BL21(DE3)為表達(dá)菌株進(jìn)行了成功表達(dá)，采用His標(biāo)簽純化得到Stlac4和Stlac6兩個(gè)漆酶蛋白。利用純化蛋白體外催化漆酶典型底物ABTS，測(cè)得Stlac4和Stlac6最適反應(yīng)溫度均為60℃，最適反應(yīng)pH均為4.0;同時(shí)檢測(cè)Li+、Na+、Mg2+、Ca2+

5、、Mn2+、Ba2+、Fe3+和Cu2+及SDS對(duì)重組漆酶酶活的影響，發(fā)現(xiàn)在Fe3+和Cu2+存在下Stlac4和Stlac6酶活明顯升高，而在高濃度抑制劑SDS存在時(shí)，兩個(gè)漆酶活性均受到明顯抑制。
　　4.以質(zhì)粒pBS為骨架，分別以草銨膦和潮霉素為抗性基因，按同源重組的原理成功構(gòu)建了StLAC4和StLAC6兩個(gè)基因的敲除載體，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得了StLAC4的基因缺失突變體，初步分析發(fā)現(xiàn)StLAC4基因的缺失導(dǎo)致突變菌株不能產(chǎn)生