玉米大斑病菌REMI轉(zhuǎn)化體系的建立和分子核型的初步分析.pdf

1、本文首先以玉米大斑病菌01-23作為供試菌株，優(yōu)化了玉米大斑病菌原生質(zhì)體的制備條件。在原生質(zhì)體制備條件成熟的基礎(chǔ)上分別建立了玉米大斑病菌REMI轉(zhuǎn)化體系與核型分析體系。 優(yōu)化的原生質(zhì)體制備條件包括：(1)以含1％葡萄糖的PDA作為產(chǎn)孢培養(yǎng)基；(2)酶解前對酶解材料進行短時渦旋處理；(3)酶解液采用1.25％溶壁酶、1.25％蝸牛酶、1.25％崩潰酶混合液，酶解時間為4h。經(jīng)過優(yōu)化后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量有了很大的提高，每毫升酶液可制備

2、10<'7>個原生質(zhì)體。在純化方面，采用3000g的速度離心10min，原生質(zhì)體損失最少：先用一層擦鏡紙過濾掉大量的菌絲碎片，再用50μM尼龍膜過濾收集原生質(zhì)體，其純化效果最佳。在再生方面，原生質(zhì)體先在液體再生培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，再在固體再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，再生率最高，效果最好。此外，試驗中還提出了一種利用菌懸液有效制備原生質(zhì)體的方法，每毫升酶液可制得2×10<'6>～5×10<'6>個原生質(zhì)體。 本文以菌種01-23為材料首次

3、成功轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌，建立了玉米大斑病菌的REMI轉(zhuǎn)化體系，該體系要點包括：(1)收集并純化原生質(zhì)體，于100μLSTC緩沖液中分裝10<'6>個原生質(zhì)體；(2)每10<'6>個原生質(zhì)體加入2μg線性PAN7-1和20單位HindⅢ；(3)滴加PTC(PEG6000)前后的冰浴時間均為20min；(4)轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體先在RPD過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)到RPDA中培養(yǎng)2～3天后在培養(yǎng)基上層覆蓋10mL含潮霉素B的PDA；(5)潮霉素對菌株01-23

4、抑菌濃度為60μg/mL。在此基礎(chǔ)上我們共獲得了225個菌株01-23的轉(zhuǎn)化子。對以上所得01-23轉(zhuǎn)化子進行菌落形念、生長量、分生孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量及致病性等五個生物學(xué)特性方面進行觀察和測定，并與野生型菌株01-23進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株M-55、M-8和M-11的菌落形態(tài)與野生型有明顯差異;菌株M-14菌落生長速度較野生型有很明顯提高，而菌株M-11生長速度有很明顯的下降；菌株M-25喪失產(chǎn)孢能力，且致病力完全喪失；比對照的產(chǎn)孢量降低

5、的菌株有M-36和M-42，比對照的產(chǎn)孢量升高的菌株有M-59和M-68。 為了建立一套全面的玉米大斑病菌核型分析體系，本文嘗試了冷凍液氮研磨法、直接包埋法、原生質(zhì)體包埋法制備玉米大斑病菌完整染色體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：原生質(zhì)體法是最易制備完整染色體的方法。并利用原生質(zhì)體技術(shù)初步建立了適于對玉米大斑病菌進行核型分析的體系。在此基礎(chǔ)上，作者利用脈沖場電泳技術(shù)首次得到了玉米大斑病菌A交配型菌株F<,1>40的三個染色體條帶和菌株a交配型F<,