花鱸HP G軸轉(zhuǎn)錄組與cyp 19 a基因的表達(dá)與功能分析.pdf

1、花鱸作為一種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，生長(zhǎng)快速且能在較大溫度范圍和不同鹽度下進(jìn)行養(yǎng)殖，是一種極好的水產(chǎn)動(dòng)物研究的模式生物?；|分布廣，遍布在東亞沿海和河口。由于野生資源有限，花鱸在中國(guó)的養(yǎng)殖變得越來(lái)越重要。目前的研究主要集中在遺傳標(biāo)記、發(fā)育、基因圖譜構(gòu)建以及與生殖、環(huán)境壓力、生長(zhǎng)和免疫相關(guān)的功能基因分析。花鱸被淡化處理后，能夠在淡水中進(jìn)行養(yǎng)殖，然而，在完全脫離海水后，成魚(yú)不能夠?qū)崿F(xiàn)完整的繁殖過(guò)程，這也是花鱸不能夠在內(nèi)陸大規(guī)模養(yǎng)殖的主要阻礙。本

2、研究中，我們主要以花鱸為實(shí)驗(yàn)材料，基于HPG軸（Hypothalamus-pituitary-gonad axis），對(duì)花鱸的腦、性腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到若干有明顯表達(dá)差異的重要生殖基因，并對(duì)cyp19a結(jié)合其啟動(dòng)子DNA甲基化進(jìn)行較為系統(tǒng)分析。主要研究結(jié)果如下：
　　1．腦、性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
　　取成年花鱸魚(yú)腦、性腺，提取總RNA，采用Illumina HiSeq2000高通量技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。共計(jì)產(chǎn)生78,256,90

3、9條clean reads，拼接得到274,909條contigs。根據(jù)序列同源性分析，注釋得到31,683條unige nes，其中20,702條unige nes出現(xiàn)在8237個(gè)GO terms和3888個(gè)信號(hào)通路中。26,623條unigenes在所有的組織中均存在，然而，748，349和319條unige nes分別特異存在于腦、卵巢和精巢中。此外，在腦與卵巢、卵巢與精巢和腦與精巢之間比較，發(fā)現(xiàn)分別有671/367、496/31

4、5和1668/580條unige ne s出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)。通過(guò)同源性分析，獲得腦-性腺軸中表達(dá)的生殖相關(guān)基因，其中包括那些參與性別分化和性別維持的基因。這些數(shù)據(jù)為花鱸的研究提供了較為完整基因資源，為HPG軸基因的功能、生殖調(diào)節(jié)以及性別基因的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。
　　2.下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸相關(guān)的基因的鑒定及其表達(dá)分析
　　通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，對(duì)所得到的所有基因進(jìn)行鑒定，其中，56個(gè)基因存在于GnRH信號(hào)通路（KEGG N

5、o.map04912），31個(gè)基因存在于類(lèi)固醇生成通路（KEGG No. map04912）中。例如GnRH受體，LH，F(xiàn)SH，LH受體，LSH受體，雄激素受體（AR），雌激素受體（ER），GSDF，CYP19a等。其中6個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期以及不同組織的表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，cyp19a主要在性腺以及腦中有表達(dá)，極少在其他組織中有表達(dá)；另一激素合成酶，3β-HSD廣泛表達(dá)與所取的七個(gè)組織中；AR和 ER在七個(gè)組織中也都有表達(dá)；與卵巢相比，GS

6、DF更顯著地表達(dá)與精巢；PIWI特異性地表達(dá)于精巢和卵巢。
　　3.MSAP方法檢測(cè)花鱸腦以及性腺組織基因組的DNA甲基化情況
　　在花鱸魚(yú)腦、精巢以及卵巢組織中，設(shè)計(jì)8對(duì)選擇性擴(kuò)增引物，在100-1000bp之間，分別共計(jì)產(chǎn)生596、580和796條擴(kuò)增條帶，其中每個(gè)個(gè)體8對(duì)組合引物平均獲得149、145和199個(gè)條帶，花鱸腦、精巢以及卵巢組織的基因組DNA甲基化指數(shù)分別為為34.23％、38.62%和47.74%。

7、>　　4.BSP法檢測(cè)花鱸腦、性腺組織中cyp19a基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)
　　通過(guò)Genomic Walking方法，PCR擴(kuò)增克隆得到花鱸cyp19a基因啟動(dòng)子序列，用亞硫酸鹽分別處理腦、精巢以及卵巢基因組DNA，擴(kuò)增分別得到處理后三組織的啟動(dòng)子序列，通過(guò)TA克隆、生工測(cè)序?qū)θM織啟動(dòng)子序列CpG位點(diǎn)進(jìn)行甲基化分析。結(jié)果顯示：cyp19a基因啟動(dòng)子在精巢以及腦組織中的甲基化程度明顯高于卵巢，均約是其2倍。啟動(dòng)子甲基化水平和cy

8、p19a基因在3組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　5.cyp19a啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄功能分析
　　通過(guò)構(gòu)建PGL-Bas ic-cyp19a熒光素酶報(bào)告載體，我們對(duì)花鱸cyp19a啟動(dòng)子在體外活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，去除-140至-46這段區(qū)域后，cyp19a啟動(dòng)子活性明顯降低（降低約58.90%），所以較長(zhǎng)的啟動(dòng)子片段表現(xiàn)出相對(duì)較高的轉(zhuǎn)錄活性。由此我們推斷：包含若干轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)SF-1,SOX,PPARE,CRE,and TAT