尼羅羅非魚轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達譜分析及Siglecs基因的表達研究.pdf

1、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)隸屬于鱸形目(Percifomes)、麗魚科(Cichlidae)、羅非魚屬(Tilapia)。因其具有適應(yīng)性強、生長快、繁殖力高和食性廣等優(yōu)點,被聯(lián)合國糧農(nóng)組織定為向世界各國推薦的養(yǎng)殖對象。中國為羅非魚養(yǎng)殖的主要國家,羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達到每年120萬噸,占世界羅非魚總產(chǎn)量的近50％。但近年來,由于養(yǎng)殖密度高、養(yǎng)殖環(huán)境惡化等原因,養(yǎng)殖羅非魚暴發(fā)了鏈球菌病,導(dǎo)致養(yǎng)殖羅非魚的大量死亡,造

2、成巨大的經(jīng)濟損失并威脅著羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究分析了無乳鏈球菌攻毒前后尼羅羅非魚的轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達譜(Digital Gene Expression, DGE)以探究細菌感染造成的羅非魚轉(zhuǎn)錄組變化,進而選定了重要免疫受體基因Siglecs進行克隆以及序列分析和組織表達研究。這些研究將有助于加深認識羅非魚抵御病原菌入侵的免疫應(yīng)答機制,為制定合理有效的羅非魚鏈球菌病防控措施以及羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。
　

3、　1.受無乳鏈球菌感染的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達譜分析
　　本研究應(yīng)用 Illumina RNA-seq技術(shù)進行尼羅羅非魚轉(zhuǎn)錄組研究,經(jīng)SOAPdenovo軟件拼接組裝,最終得到82,799 Unigenes(平均大小:618 bp)。Unigenes通過與Nr, Swissprot, COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins), KEGG(Kyoto Encyclopedi

4、a of Genes and Genomes)以及 GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫進行BlastX比對,得到功能注釋。以此轉(zhuǎn)錄組拼接Unigenes作為參考序列,結(jié)合DGE技術(shù),我們對無乳鏈球菌攻毒前后的尼羅羅非魚轉(zhuǎn)錄組變化進行研究。結(jié)果得到774條表達顯著上調(diào)的Unigenes以及625條表達顯著下調(diào)的Unigenes,其中,293個差異表達基因能夠注釋到181條信號通路中,包括17條免疫相關(guān)的信號通路(涉及65個差異表達基

5、因)。另外,我們還對 Toll-like receptor信號通路中的6個差異表達的基因進行了實時熒光定量 PCR檢測,結(jié)果驗證了DGE分析的可靠性。本研究得到的大量轉(zhuǎn)錄組組裝序列豐富了羅非魚基因序列資源,得到的差異表達基因及其相關(guān)通路分析為進一步了解羅非魚抗鏈球菌感染機制以及其他免疫相關(guān)研究提供了寶貴資源。
　　2.尼羅羅非魚Siglec基因的克隆與組織表達分析
　　克隆得到尼羅羅非魚 Siglec-1和 Siglec-1

6、4基因。Siglec-1基因的ORF為1350bp,編碼氨基酸449個。蛋白初級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示, Siglec-1具有信號肽1個,Ig-like結(jié)構(gòu)域3個,跨膜結(jié)構(gòu)域1個以及胞質(zhì)區(qū)ITIM結(jié)構(gòu)域1個。在系統(tǒng)進化樹中,魚類的Siglec-1聚為一支,哺乳類的則聚為另一支。Siglec-14基因的ORF為921bp,編碼氨基酸306個。蛋白初級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,Siglec-14具有信號肽1個,Ig-like結(jié)構(gòu)域2個,跨膜結(jié)構(gòu)域1個。實