銀杏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及葉片與胚珠數(shù)字基因表達(dá)譜分析.pdf

1、胚珠是種子植物最重要的生殖結(jié)構(gòu)，在其生命周期和世代交替過程中起到關(guān)鍵作用。目前被子植物胚珠發(fā)育的分子遺傳機(jī)理已被廣泛研究，而裸子植物胚珠的相關(guān)研究卻非常有限。銀杏作為現(xiàn)存最古老的裸子植物之一，已有形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)研究表明銀杏胚珠的生殖結(jié)構(gòu)與功能具有早期種子植物很多原始特征，此外，在少量現(xiàn)存銀杏與古生代銀杏類植物中，發(fā)現(xiàn)銀杏胚珠還具有葉生擬胚珠的形態(tài)特征。因此，從基因組水平上系統(tǒng)研究銀杏胚珠的發(fā)育機(jī)制具有重要的科學(xué)價(jià)值。前人有關(guān)銀杏的分子水

2、平研究主要僅集中在次生代謝物合成及系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化等方面，而從基因組水平上對(duì)銀杏胚珠與葉片之間共性表達(dá)及差異表達(dá)的功能基因系統(tǒng)比較研究未見報(bào)道。本研究利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法對(duì)銀杏雌葉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，并對(duì)銀杏胚珠與葉片進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜的比較與分析，確定了大量共同表達(dá)與差異表達(dá)的功能基因以及與胚珠發(fā)育相關(guān)基因，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)應(yīng)用改良后的CTAB法分別成功提取銀杏葉片與胚珠的總RNA，質(zhì)檢合

3、格后，被用于轉(zhuǎn)錄組及數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序。
　　(2)基于Illumina High-seqTM2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)銀杏葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總共獲得了56，341，460個(gè)raw reads，經(jīng)過去除低質(zhì)量的序列，接頭序列，含N的比例大于5％的序列獲得54，253，512個(gè)clean reads，Q20高達(dá)97.21％，測(cè)序質(zhì)量高。De novo組裝最終獲得77，898個(gè)平均長(zhǎng)度高達(dá)829 bp，N50為1743bp的unigenes

4、，豐富了銀杏轉(zhuǎn)錄組信息。
　　(3)經(jīng)BLASTx將所有unigenes比對(duì)到6大數(shù)據(jù)庫中，總共有42，624條unigenes得到了基因功能注釋，占所有unigenes總量的54.72％。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋結(jié)果，代謝途徑分析顯示共有1859個(gè)unigenes被注釋到18種主要的次生代謝物生物合成途徑當(dāng)中，其中獲得可能參與銀杏類黃酮合成的90個(gè)unigenes(編碼11個(gè)關(guān)鍵酶)。此外還獲得參與銀杏萜內(nèi)脂生物合成的61個(gè)un

5、igenes(編碼17個(gè)關(guān)鍵酶)。根據(jù)Swiss-prot注釋結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了855個(gè)unigenes編碼16類轉(zhuǎn)錄因子，可能參與了調(diào)控銀杏葉片生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成、次生代謝物合成、逆境脅迫等多個(gè)生物學(xué)過程;確定了許多與發(fā)育相關(guān)的候選基因。
　　(4)銀杏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的unigene序列聯(lián)合已公布的銀杏轉(zhuǎn)錄本序列，共同組成100，124條參考序列供DGE測(cè)序與比對(duì)分析。經(jīng)去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，從銀杏葉片與胚珠DGE測(cè)序中分別獲得11，5

6、97，234和12，459，128條clean reads，完美比對(duì)上參考序列的clean reads分別達(dá)到80.21％與74.48％，表明比對(duì)結(jié)果好。測(cè)序飽和度及隨機(jī)性分布顯示測(cè)序質(zhì)量較好。
　　(5)基因定量分析結(jié)果顯示了銀杏葉片與胚珠間存在42，149個(gè)共同表達(dá)的基因，分別有14，679個(gè)與6301個(gè)特異表達(dá)基因存在于葉片及胚珠中。在葉片中高度表達(dá)的基因編碼的蛋白可能參與植物防御和光合作用過程;在胚珠中高度表達(dá)的基因編碼了

7、的蛋白參與了細(xì)胞壁的合成，分泌作用及類黃酮合成等生物學(xué)過程。更重要的是，分析還確定了121與胚珠發(fā)育緊密相關(guān)的同源基因。
　　(6)對(duì)銀杏葉片與胚珠形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)觀察，葉脈呈二歧分枝狀與胚珠對(duì)生于單一短枝上的形態(tài)結(jié)構(gòu)類似;葉片與胚珠都呈綠色，含有葉綠體;葉片與胚珠表面都分布大量氣孔，這些結(jié)果顯示葉片與胚珠形態(tài)與結(jié)構(gòu)上具有許多相似的特征。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從基因表達(dá)水平上分析確定許多參與氣孔發(fā)育、葉綠體發(fā)育及光合作用等光合過程中的共同

8、表達(dá)基因，并使用熒光定量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的一致性，顯微觀察與功能基因表達(dá)證實(shí)銀杏胚珠與葉片一樣，也具有葉綠素合成、光合作用及氣體交換等生物學(xué)功能。
　　(7)經(jīng)差異基因表達(dá)篩選，銀杏葉片與胚珠間差異表達(dá)基因共11，434條，其中葉片相對(duì)于胚珠有4575條基因上調(diào)表達(dá)，有6859條基因下調(diào)表達(dá)。通過差異基因GO功能顯著性富集分析，細(xì)胞分裂(GO∶0051301)，細(xì)胞分化(GO∶0030154)，DNA復(fù)制的起始(GO∶000626

9、1)，激素轉(zhuǎn)導(dǎo)(GO∶0009914)，花器官的形成(GO∶0048449)等terms被顯著富集;KEGG功能顯著性富集分析結(jié)果顯示38條pathways被顯著富集，主要包括代謝通路，次生代謝物合成，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。這些顯著富集的GO terms和pathways中大部分DEGs是在葉片中呈下調(diào)趨勢(shì)，這些結(jié)果表明DEGs顯著富集的功能通路與葉片及胚珠的生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)和進(jìn)程有著緊密的協(xié)同性
　　(8)經(jīng)聚類分析與高度差異表達(dá)基因