野桑蠶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與正向選擇基因分析.pdf

1、野桑蠶（Bombyx mandarina）屬于昆蟲(chóng)綱鱗翅目蠶蛾科，又稱(chēng)野蠶，被廣泛認(rèn)為是家蠶(Bombyx mori)的祖先。人們?yōu)榱颂岣呓z的產(chǎn)量與品質(zhì)，馴化了野桑蠶至少5000年，從而獲得家蠶，兩者之間出現(xiàn)了許多明顯差異，包括幼蟲(chóng)體型的大小，體色的變化，繭的大小與絲的質(zhì)量的改變，免疫能力的下降以及成蟲(chóng)飛行能力的喪失與產(chǎn)卵行為的變化等等。因此，野桑蠶和家蠶已經(jīng)成為研究物種馴化的一對(duì)理想模型。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及de novo組裝策

2、略的出現(xiàn)，使研究無(wú)參考基因組物種的轉(zhuǎn)錄組成為可能。本研究利用Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)研究野桑蠶轉(zhuǎn)錄組，試圖通過(guò)分析正向選擇基因來(lái)從轉(zhuǎn)錄組水平探索家蠶馴化機(jī)制。這些數(shù)據(jù)不僅作為分析家蠶馴化機(jī)制有效途徑，同時(shí)還為今后的野桑蠶基因組研究提供參考?；诖耍狙芯繉?duì)野桑蠶中部絲腺(MSG)及后部絲腺(PSG)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)分析獲得如下結(jié)果:
　　1、野桑蠶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與de novo組裝及SNP鑒定
　　本研究

3、分離并收集到單個(gè)野桑蠶末齡幼蟲(chóng)個(gè)體的兩個(gè)組織:MSG和PSG，分別提取總RNA并構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總共獲得120，381，200條paired-end reads的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)過(guò)濾接頭、低質(zhì)量序列以及rRNA序列后，得到總計(jì)100，004，078條高質(zhì)量的干凈reads，占原始數(shù)據(jù)的83.07％，GC百分比為46.50％。通過(guò)de novo組裝，得到總共50，773條轉(zhuǎn)錄本（transcripts），其中轉(zhuǎn)錄本N50長(zhǎng)度

4、為1764 bp，平均長(zhǎng)度為941.62 bp。鑒定到總計(jì)33，759個(gè)unigene，其中unigene N50長(zhǎng)度為1437 bp，平均長(zhǎng)度為762.20 bp。將unigene分別與不同蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行注釋?zhuān)灿?2，805個(gè)在Nr庫(kù)中有注釋?zhuān)?273個(gè)在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋?zhuān)赟wiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中共有9093個(gè)unigene擁有注釋。而在對(duì)unigene的功能注釋中，從GO、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定分別

5、到9571、5893和6245個(gè)unigene。Unigene的注釋情況表明組裝效果良好，為后續(xù)分析奠定基礎(chǔ)。此外，總共鑒定了32，297個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及361個(gè)插入缺失(INDEL)，顯示了野桑蠶較高的雜合性。
　　2、野桑蠶轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析
　　本研究對(duì)MSG和PSG轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了表達(dá)譜分析，總共鑒定到1308個(gè)有顯著差異表達(dá)的unigene，其中883個(gè)在MSG上調(diào)表達(dá)，425個(gè)在PSG上調(diào)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)有

6、三種絲膠基因（sericin1，sericin2，和sericin3）在MSG特異表達(dá)，而有三種絲素基因（fibroin-H，fibroin-L，和fibroin/P25）則在PSG特異表達(dá)，其他絲蛋白基因特異表達(dá)情況也均與家蠶相同。此外，通過(guò)比較野桑蠶與家蠶各絲蛋白基因蛋白序列，發(fā)現(xiàn)絲素輕鏈的氨基酸相似度為99.2％，絲素/P25則為99.0％，兩者均有2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生氨基酸替換;而在絲膠蛋白中，絲膠1除去52個(gè)氨基酸的gap外，氨基酸相

7、似度達(dá)到98.0％，存在13處氨基酸替換;絲膠2則有多達(dá)477個(gè)氨基酸gap，余下氨基酸相似度為98.7％，有8處氨基酸替換;野桑蠶絲膠3蛋白比家蠶在首端多出13個(gè)氨基酸，除此以外的氨基酸相似度為91.8％，共有12處氨基酸替換。這表明絲素輕鏈與絲素/P25蛋白序列比較保守，絲膠蛋白的變化則要大一些，除保守區(qū)域外具有不同程度的氨基酸插入與缺失。而對(duì)fibrohexamerin蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析表明，該蛋白很可能從馴化以前的野桑蠶時(shí)期就已經(jīng)

8、有多個(gè)基因。
　　3、野桑蠶正向選擇基因鑒定及功能分析
　　本研究通過(guò)與家蠶p50/Dazao基因集比較，總共鑒定到5295對(duì)潛在的直系同源基因，通過(guò)去除旁系同源基因等，總共鑒定了2806對(duì)同時(shí)擁有非同義替換(Ka)和同義替換(Ks)的直系同源基因。利用Ka/Ks分析法，發(fā)現(xiàn)了400對(duì)直系同源基因已經(jīng)經(jīng)歷或正在經(jīng)歷正向選擇，其中有83對(duì)已經(jīng)經(jīng)歷正向選擇，而有317對(duì)則是正在經(jīng)歷正向選擇。利用KEGG富集分析方法對(duì)上述正向選擇