野桑蠶肌原纖維鈣結(jié)合蛋白及相關(guān)蛋白的基因分析.pdf

1、野桑蠶(BombyxmandarinaM.)是蠶業(yè)的害蟲(chóng)，而家蠶(BombyxmoriL.)是一種經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，它們是由古野桑蠶在不同的選擇壓力下進(jìn)化來(lái)的?，F(xiàn)在的家蠶和野桑蠶在很多方面存在差異，其中的運(yùn)動(dòng)性狀差異是比較有趣的。 本文是從野桑蠶肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白的基因入手，研究野桑蠶的肌肉調(diào)節(jié)機(jī)制；同時(shí)用生物信息學(xué)的方法與家蠶相對(duì)應(yīng)的基因作比較分析?？寺〉揭吧ＰQ肌球蛋白輕鏈2、肌鈣蛋白C和肌鈣蛋白I的4個(gè)亞型的cDNA，分析了基因序列

2、和基因結(jié)構(gòu)，探討了基因的組織表達(dá)模式，為深入研究野桑蠶的肌肉系統(tǒng)提供了參考，為探索家蠶和野桑蠶的運(yùn)動(dòng)差異提供了相關(guān)的基因信息。研究結(jié)果如下： 1.野桑蠶肌鈣蛋白C基因的克隆和序列分析肌鈣蛋白C(TnC)是肌鈣蛋白復(fù)合體的Ca2+結(jié)合亞基，在黑腹果蠅和田鱉中研究的較多。我們克隆到長(zhǎng)度為851bp的近全長(zhǎng)野桑蠶肌鈣蛋白C基因，包括100bp的5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)、477bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)、終止密碼子TAA和271bp的3'

3、非編碼區(qū)。該cDNA編碼159個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，肽鏈帶有較多的負(fù)電荷因而具有結(jié)合Ca2+的能力，具有TnC蛋白的保守序列：DX[DN]X[DSG]X6E。野桑蠶TnC氨基酸序列與果蠅TnC73F(NP_524122)氨基酸序列的同源性高達(dá)82％，而與果蠅TnC其它亞型的同源性比較差，與已經(jīng)報(bào)道的家蠶有相同的氨基酸序列。 2.野桑蠶肌鈣蛋白I基因的克隆和序列分析在許多昆蟲(chóng)中，肌鈣蛋白I(TnI)的多個(gè)亞型由單基因編碼而產(chǎn)生，TnI

4、主要功能是在靜止時(shí)抑制肌動(dòng)球蛋白的形成。我們以野桑蠶成蟲(chóng)的mRNA為模板，通過(guò)RT-PCR克隆到肌鈣蛋白I的4個(gè)亞型，分別命名為：TnI-A、TnI-B、TnI-C和TnI-D(GenBank登錄號(hào)分別為：FJ785828、FJ785829、FJ785830和FJ890515)。這4個(gè)亞型的氨基酸序列分析顯示，它們具有肌鈣蛋白家族的特征。與電子克隆到的相應(yīng)的家蠶TnI亞型比較分析，結(jié)果顯示：野桑蠶與家蠶TnI-B有相同的氨基酸，TnI-

5、A和TnI-C有一個(gè)氨基酸的差別，而在家蠶中沒(méi)有電子克隆到與野桑蠶TnI-D相同的亞型。 3.野桑蠶肌球蛋白輕鏈2基因的克隆分析利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆了野桑蠶間接飛行肌(indirectflightmuscle，IFM)的肌球蛋白輕鏈2(myosinlightchain2，MLC2)基因全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào)：EU332913)，其cDNA序列全長(zhǎng)979bp，包括6

6、3bp的5'UTR、603bp的開(kāi)放讀碼框(openreadingframe，ORF)、終止密碼子TAA和310bp的3'URT。通過(guò)克隆該基因的內(nèi)含子序列，分析基因結(jié)構(gòu)表明：該基因包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。MLC2基因編碼201個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量約為22.0kD，等電點(diǎn)(pI)為4.67。用在線軟件SMART分析顯示，野桑蠶MLC2蛋白有2個(gè)EFh結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合Ca2+，屬于肌鈣蛋白C超家族成員；同時(shí)發(fā)現(xiàn)野桑蠶MLC2蛋白

7、具有保守的可以磷酸化的氨基酸殘基，有可能具有磷酸化過(guò)程，參與肌動(dòng)球蛋白ATPase活性的調(diào)節(jié)。 4.家蠶和野桑蠶蛾期MLC2基因的表達(dá)模式用實(shí)時(shí)定量PCR分析家蠶和野桑蠶MLC2基因在蛾期的表達(dá)模式，結(jié)果顯示：MLC2基因在家蠶與野桑蠶中的表達(dá)沒(méi)有差異。它們都有一個(gè)相同的表達(dá)趨勢(shì)：在5齡時(shí)，表達(dá)量較低；在羽化時(shí)，有了很大的增加；但是在羽化后5小時(shí)，MLC2的表達(dá)量有稍微的下降；隨后在羽化7小時(shí)和羽化1天時(shí)，基因表達(dá)量都是增加的。