布渣葉轉(zhuǎn)錄組測序及ACGs生物合成關(guān)鍵基因的挖掘.pdf

1、布渣葉（Microcos paniculata）是椴樹科家族中的重要一員，其干燥葉片常被用作中藥或“涼茶”原料。研究表明，布渣葉富含黃酮類成分。其中，芹菜素C-苷（Apigenin C-glycosides，ACGs）類代謝物含量豐富，具有抗炎、抗氧化、抗癌等多種生物活性。由于布渣葉資源逐步受到破壞，ACGs分離提取困難，致使ACGs的相關(guān)研究及開發(fā)利用較之其他黃酮類成分相對滯后。本文旨在以高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究S1、S2、S3及S4

2、四個不同生長階段的布渣葉轉(zhuǎn)錄組，結(jié)合HPLC活性成分定量分析，以期挖掘布渣葉ACGs生物合成的關(guān)鍵基因，為布渣葉的種質(zhì)保育、基因功能驗(yàn)證、時空表達(dá)調(diào)控機(jī)制等分子研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下：
　?。?）采集廣東、廣西、海南及云南四省共14個野生居群的布渣葉，提取其基因組DNA，擴(kuò)增其ITS2和psbA-trnH序列。測序后進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示布渣葉樣品的ITS2序列存在12個變異位點(diǎn)，Pairwise Dista

3、nce在0.000～0.020間；除S14（云南景洪）居群的樣品在247bp～254bp處缺失一個8bp片段外，所有布渣葉樣品的psbA-trnH序列完全一致，Pairwise Distance為0.000?；诓荚~ITS2和psbA-trnH序列及其近源種植物相應(yīng)條形碼序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示14個居群的布渣葉樣品均區(qū)別于其他近源種，聚為一個獨(dú)立的單枝。綜上，建立了以psbA-trnH為主，ITS2為輔的布渣葉DNA條形碼鑒定體系

4、。
　?。?）提取S1、S2、S3及S4四個不同生長階段布渣葉的總RNA，富集純化mRNA，構(gòu)建cDNA文庫，采用Illumina HiseqTM4000高通量測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。Clean reads經(jīng)de novo組裝得到46,135條Unigene，平均長度為1,156bp，N50為1,946bp。在所有的Unigene中，有25,587（55.46％）條經(jīng)BLAST在公共數(shù)據(jù)庫Nr（30,085條），SwissProt

5、（22,803條），KOG（18,761條）和KEGG（11,864條）中檢索到高度同源序列而獲得注釋。以此布渣葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)量，對差異基因進(jìn)行GO富集分析、KEGG富集分析、趨勢分析，以闡述布渣葉生長過程中基因表達(dá)模式的變化規(guī)律。
　　（3）在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫注釋的基礎(chǔ)上，結(jié)合差異基因趨勢分析與CDS結(jié)果預(yù)測，篩選得到ACGs生物合成相關(guān)的18個關(guān)鍵候選基因，分別為PAL（Unigene0032009、Unige

6、ne0032844），C4H（Unigene0032574），4CL（Unigene0026100、Unigene0029308），CHS（Unigene0016055、Unigene0018698），CHI（Unigene0016201），F(xiàn)2H（Unigene0021527），CGT（Unigene0014826、Unigene0026612），DHR（Unigene0020658）,bHLH（Unigene0018327、Unig

7、ene0044249）和MYB（Unigene0017599、Unigene0030071、Unigene0044545、Unigene0045985）。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了候選基因在布渣葉生長過程中的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組所統(tǒng)計(jì)的結(jié)果相符，證明RNA-Seq定量基因的準(zhǔn)確性。同時，采用HPLC測定S1、S2、S3及S4樣品中的維采寧-1、維采寧-2、牡荊苷、異牡荊苷、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、MpACG-2、MpACG-3及MpACG-4的

8、相對含量。結(jié)果表明，大多數(shù)ACGs在布渣葉S1-S2生長階段含量持續(xù)增加，在S2達(dá)到最大值，之后隨著生長時間延長而含量逐漸減少，這與所篩選的候選基因的表達(dá)趨勢十分相似。
　?。?）通過ORF finder在線工具預(yù)測MpCHS2基因的開放閱讀框，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其cDNA序列。產(chǎn)物與pET-30a(+)分別進(jìn)行XhoI及BglII雙酶切，在連接酶作用下構(gòu)建MpCHS2-pET-30a(+)重組載體。將重組載體導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，

9、在含Kan抗生素（100μg/mL）LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行Sanger測序。實(shí)驗(yàn)獲得MpCHS2基因的序列，其cDNA長為1,176bp（GenBank登錄號KY472608），編碼391個氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)分子量42.7KDa，理論等電點(diǎn)6.11，不含信號肽，不含跨膜域，所編碼的蛋白質(zhì)親疏水性介于+2.422～-2.489間，具有兩親性。
　　本論文結(jié)合了分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、分析化學(xué)等多種學(xué)科技術(shù)