羅漢果轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜的高通量測序及甜苷V生物合成關(guān)鍵酶的克隆.pdf

1、羅漢果Siraitiagrosvenorii(Swingle)C．Jeffrey是我國特有珍貴藥用和甜料植物，為葫蘆科(Cucurbitaceae)羅漢果屬(Siraitia)多年生藤本植物，具有止咳祛痰、涼血舒胃、潤腸通便等作用。其主要成分甜苷V是世界上最強(qiáng)的非糖甜味物質(zhì)之一，為蔗糖甜度的300-400倍，是一種低熱量、純天然的甜味劑及理想的保健品，此外還有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、降血糖等作用。甜苷V目前還不能化學(xué)合成，主要依靠提取獲

2、得。羅漢果對生境要求苛刻，只適宜在廣西生長，且栽培中不能連作，果實中甜苷V含量低，無法滿足市場需求，因此亟待探索提高甜苷V含量的新途徑、新方法。本論文利用高通量測序技術(shù)對羅漢果果實的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜進(jìn)行了研究，從分子水平闡釋羅漢果甜苷V生物合成的分子機(jī)理，大規(guī)模尋找羅漢果功能基因，并在此基礎(chǔ)上克隆了甜苷V生物合成相關(guān)基因的全長。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．羅漢果授粉后30天到50天之間主要以苦味成分苷ⅡE為主，70天時含量急劇下

3、降，檢測不到苷ⅡE。苷Ⅲ只在50天果實中出現(xiàn)。苷V含量在50天之前含量低，在50天至70天之間急劇增長了25.9倍，至85天增長到最高含量。葡萄糖含量在30天和50天變化不明顯，而70天下降了3.24倍。葡萄糖含量與苷ⅡE、苷V含量的變化存在一定的消長關(guān)系。
　　 2．應(yīng)用Solexa高通量測序技術(shù)對羅漢果果實進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到3.41G的原始數(shù)據(jù)，通過拼接得到43891條Unigenes。與次生代謝相關(guān)的unigenes有7

4、39條，其中涉及萜類骨架合成的Unigenes有60條。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了羅漢果甜苷V生物合成通路中幾乎所有的基因，涉及到20種基因。另外還得到了80條P450基因Unigenes、72條glycosyltransferase基因的Unigenes和90條glucosyltransferase基因的Unigenes。這些Unigenes是今后對羅漢果三萜皂苷生物合成進(jìn)行全面調(diào)控的重要基因資源。
　　 3．在3d、50d、70d

5、表達(dá)譜中均得到了300萬條以上Cleantags，去冗余后得到85000條以上不同種類的Tags。通過分析發(fā)現(xiàn)占mRNA總量近73-76％的是種類不到5.1-5.9％的少數(shù)mRNA，而占種類56-59％的mRNA全部加起來不到mRNA總量的3.9-4.1％。對差異基因進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在3d/50d中，有2119個基因上調(diào)，2642個基因下調(diào)；3d/70d中，2150個基因上調(diào)，2797個基因下調(diào)；50d/70d中，1078個基因上調(diào)，142

6、2個基因下調(diào)。
　　 4．利用表達(dá)譜對羅漢果甜苷V生物合成途徑涉及的20種基因在各個時期的表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)除AACT、MVD、CMK、HDS、SQS基因表達(dá)量在3個時期中未見明顯變化外，其余16個基因都有各自的變化規(guī)律。授粉后3天到50天之間，DXS、DXR、MCS、IDS下調(diào)，其余12種基因均上調(diào)。50天到70天之間，HMGR、MCS、IDS、IPP、GPS、FPS、CAS下調(diào)外，其余9種個基因均上調(diào)。從3天幼果到70天接

7、近成熟果實，各個基因表達(dá)的總體趨勢是：除DXR、MCS、IDS、IPP-Ⅰ表現(xiàn)下調(diào)外，HMGS、HMGR、MK、PMK、MCT、IPI-Ⅱ、GPS、FPS、SQS、CAS和CS基因均上調(diào)。其中SQE和CS變化最大，70天比3d的表達(dá)量分別提高了8.89倍和9.69倍。
　　 5．通過對80條CytochromeP450Unigenes和90條glucosyltransferaseUnigenes基因表達(dá)水平變化規(guī)律進(jìn)行研究，推測

8、Unigene23541、Unigene24189、Unigene26598和Unigene43109等4條候選的P450基因和Unigene4016、Unigene8672、Unigene13633、Unigene15400、Unigene35056和Unigene38974等6條候選的UDPG基因可能參與甜苷V骨架生物合成。
　　 5．利用RACE技術(shù)首次克隆了14條羅漢果甜苷V生物合成相關(guān)的基因全長和4條5’或3’片段。其

9、中MVA途徑有6條：AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK、MVD;共同代謝途徑中IPI、GPS、FPS、SQS、CAS、CS等6條，以及SQE5’端；MEP途徑中MCT和IDS基因的全長、DXS和HDS的5’端以及MCS的3’端。此外還得到了2條糖基轉(zhuǎn)移酶的全長。并對所有全長基因進(jìn)行了序列分析，它們均為首次從羅漢果中報道的全長或部分片段序列。
　　 本論文首次利用Solexa高通量測序技術(shù)對羅漢果果實的轉(zhuǎn)錄組及不同時期的表