利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選控制白色獺兔皺襞性狀相關(guān)基因.pdf

1、獺兔，典型的皮用兔，因被毛獨(dú)特而倍受人們喜愛。近年來，在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，某些獺兔會(huì)在腹部和四肢以及臀部出現(xiàn)皺褶，稱其為皺襞型獺兔。皺襞型獺兔的個(gè)體比非皺襞型稍大，同時(shí)具有正常獺兔相同的皮毛品質(zhì)，這對(duì)于以皮張面積和皮毛品質(zhì)為重要經(jīng)濟(jì)效益因素的獺兔來說，意義重大，提供了新的獺兔育種方向。
　　本研究采用RNA-Seq技術(shù)，對(duì)皺襞型（試驗(yàn)組）和非皺襞型（對(duì)照組）白色獺兔的皮膚樣本進(jìn)行測(cè)序分析。分析測(cè)序結(jié)果，篩選出與皮膚生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因。將

2、樣本的有效reads合并，通過Trinity軟件，使用兩端重復(fù)進(jìn)行de novo拼接。兩組皮膚樣本測(cè)序總共獲得377，618條Unigenes，Unigenes的平均長(zhǎng)度是680 nt，最長(zhǎng)的序列長(zhǎng)達(dá)20，293 nt。
　　將Unigenes與NR、Swiss-Prot、KEGG和KOG等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)(E-Value＜10-5)，根據(jù)比對(duì)的注釋，分析已知Unigene的功能。由于家兔的全基因組信息還不完善，85.5931％序列無法

3、比對(duì)到任何數(shù)據(jù)庫(kù)上。根據(jù)NR注釋及Blast2GO，總共有42，895條Unigene被映射到不同的GO term上，并按照分子功能、細(xì)胞組分及生物過程將其分類;KOG的結(jié)果顯示60，593條Unigenes被分為25類。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示，13，431條Unigene分別被注釋到399個(gè)KEGG pathway中，其中注釋到PI3K-Akt信號(hào)通路(ko04151)的基因最多(686，5.108％)，該信號(hào)通路在皮膚的生長(zhǎng)發(fā)育過程

4、中具有重要的意義。
　　兩種不同表型的樣本中，共有308個(gè)顯著的差異表達(dá)基因(P-Value≤0.05且log2|foldchange|＞1)，其中118個(gè)在皺襞型樣品中為上調(diào)基因，190個(gè)為下調(diào)基因。這些基因中有99個(gè)被注釋到不同的GO Term上，其中只有29個(gè)基因被注釋到KEGG不同的代謝途徑中。除此之外的209個(gè)基因被稱為新基因，在這些基因中，33個(gè)只在非皺襞型個(gè)體中表達(dá)，56個(gè)基因只在皺襞型個(gè)體中表達(dá)。
　　通過q

5、RT-PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。選擇7個(gè)候選基因，使用oligo7.0設(shè)計(jì)特異性引物，采用ΔΔCt法計(jì)算皺襞型和非皺襞型樣品的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，qRT-PCR的結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果相符。說明測(cè)序結(jié)果是正確的，據(jù)此初步確定與家兔皮膚發(fā)育相關(guān)的基因:MYL12B、LAMB3、PLON，EIF3E、CEBPA、FADS2,ENPP6等。
　　候選基因MYL12B是細(xì)胞骨架的重要組分，作為肌球蛋白的調(diào)節(jié)性輕鏈，可通過調(diào)節(jié)輕鏈的磷酸化與去磷

6、酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多動(dòng)力學(xué)過程。本研究克隆了MYL12B基因的CDS序列，并與人、黑猩猩、小鼠等12個(gè)物種的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)，除馬外，該基因與哺乳動(dòng)物CDS相似性高達(dá)94％，與鳥類和兩棲類的同源性也較高。生物信息學(xué)分析顯示MYL12編碼的蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定的、具有一定親水性的結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)富含磷酸化和糖基化位點(diǎn)。同時(shí)該基因的CDS序列在皺襞型和非皺襞型的個(gè)體中沒有序列的差異，表達(dá)量的差異可能是由肌球蛋白作用機(jī)制決定的。

7、
　　本研究采用PCR-SSCP技術(shù)，設(shè)計(jì)候選基因LAMB3第5、6、7、8、9和10等外顯子的特異性引物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，將不同帶型的PCR產(chǎn)物送生物工程公司測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMB3第8外顯子存在1個(gè)潛在的突變位點(diǎn)，通過統(tǒng)計(jì)分析，這些突變位點(diǎn)在皺襞型和非皺襞型白色獺兔的皮膚組織樣品中具有顯著性差異。
　　本研究首次將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于白獺兔皺襞性狀的探索中，初步確定與皺襞性狀相關(guān)的基因，并通過該基因的功能注釋