利用轉(zhuǎn)錄組測序篩選控制白色獺兔皺襞性狀相關(guān)基因.pdf

1、獺兔，典型的皮用兔，因被毛獨特而倍受人們喜愛。近年來，在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，某些獺兔會在腹部和四肢以及臀部出現(xiàn)皺褶，稱其為皺襞型獺兔。皺襞型獺兔的個體比非皺襞型稍大，同時具有正常獺兔相同的皮毛品質(zhì)，這對于以皮張面積和皮毛品質(zhì)為重要經(jīng)濟(jì)效益因素的獺兔來說，意義重大，提供了新的獺兔育種方向。
　　本研究采用RNA-Seq技術(shù)，對皺襞型（試驗組）和非皺襞型（對照組）白色獺兔的皮膚樣本進(jìn)行測序分析。分析測序結(jié)果，篩選出與皮膚生長發(fā)育相關(guān)的基因。將

2、樣本的有效reads合并，通過Trinity軟件，使用兩端重復(fù)進(jìn)行de novo拼接。兩組皮膚樣本測序總共獲得377，618條Unigenes，Unigenes的平均長度是680 nt，最長的序列長達(dá)20，293 nt。
　　將Unigenes與NR、Swiss-Prot、KEGG和KOG等數(shù)據(jù)庫比對(E-Value＜10-5)，根據(jù)比對的注釋，分析已知Unigene的功能。由于家兔的全基因組信息還不完善，85.5931％序列無法

3、比對到任何數(shù)據(jù)庫上。根據(jù)NR注釋及Blast2GO，總共有42，895條Unigene被映射到不同的GO term上，并按照分子功能、細(xì)胞組分及生物過程將其分類;KOG的結(jié)果顯示60，593條Unigenes被分為25類。KEGG數(shù)據(jù)庫比對顯示，13，431條Unigene分別被注釋到399個KEGG pathway中，其中注釋到PI3K-Akt信號通路(ko04151)的基因最多(686，5.108％)，該信號通路在皮膚的生長發(fā)育過程

4、中具有重要的意義。
　　兩種不同表型的樣本中，共有308個顯著的差異表達(dá)基因(P-Value≤0.05且log2|foldchange|＞1)，其中118個在皺襞型樣品中為上調(diào)基因，190個為下調(diào)基因。這些基因中有99個被注釋到不同的GO Term上，其中只有29個基因被注釋到KEGG不同的代謝途徑中。除此之外的209個基因被稱為新基因，在這些基因中，33個只在非皺襞型個體中表達(dá)，56個基因只在皺襞型個體中表達(dá)。
　　通過q

5、RT-PCR驗證測序結(jié)果。選擇7個候選基因，使用oligo7.0設(shè)計特異性引物，采用ΔΔCt法計算皺襞型和非皺襞型樣品的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，qRT-PCR的結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果相符。說明測序結(jié)果是正確的，據(jù)此初步確定與家兔皮膚發(fā)育相關(guān)的基因:MYL12B、LAMB3、PLON，EIF3E、CEBPA、FADS2,ENPP6等。
　　候選基因MYL12B是細(xì)胞骨架的重要組分，作為肌球蛋白的調(diào)節(jié)性輕鏈，可通過調(diào)節(jié)輕鏈的磷酸化與去磷

6、酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多動力學(xué)過程。本研究克隆了MYL12B基因的CDS序列，并與人、黑猩猩、小鼠等12個物種的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)，除馬外，該基因與哺乳動物CDS相似性高達(dá)94％，與鳥類和兩棲類的同源性也較高。生物信息學(xué)分析顯示MYL12編碼的蛋白是一個不穩(wěn)定的、具有一定親水性的結(jié)構(gòu)蛋白，同時富含磷酸化和糖基化位點。同時該基因的CDS序列在皺襞型和非皺襞型的個體中沒有序列的差異，表達(dá)量的差異可能是由肌球蛋白作用機(jī)制決定的。

7、
　　本研究采用PCR-SSCP技術(shù)，設(shè)計候選基因LAMB3第5、6、7、8、9和10等外顯子的特異性引物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，將不同帶型的PCR產(chǎn)物送生物工程公司測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMB3第8外顯子存在1個潛在的突變位點，通過統(tǒng)計分析，這些突變位點在皺襞型和非皺襞型白色獺兔的皮膚組織樣品中具有顯著性差異。
　　本研究首次將轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用于白獺兔皺襞性狀的探索中，初步確定與皺襞性狀相關(guān)的基因，并通過該基因的功能注釋