黃瓜性別決定基因M的精細定位及轉(zhuǎn)錄表達譜分析.pdf

1、性別分化是植物的基本發(fā)育過程，由于作物的性別表達類型決定了其育種和栽培的方式，所以控制性別表達具有重要經(jīng)濟意義，黃瓜(Cucumis Sativus L.)具有非常豐富的性別表現(xiàn)類型，是研究植物性別表達的模式植物。黃瓜花有雄花、雌花和兩性花三種類型，但幼花蕾最初都是兩性花原基，在進一步發(fā)育中兩性花原基中雄蕊的滯育形成雌花，雌蕊的滯育形成雄花，雄蕊和雌蕊都發(fā)育則形成兩性花。目前已經(jīng)明確控制黃瓜性別表達的主效基因位點有F、M和A三個。除遺傳

2、因素外，黃瓜性別表達還受環(huán)境和激素的調(diào)控，長日照、高溫、赤霉素促進雄花產(chǎn)生，而短日照、低溫、乙烯則促進雌花形成。激素在黃瓜的性別表達中起重要作用。黃瓜性別表達的乙烯控制模型認為：乙烯既促進雌蕊發(fā)育，又抑制雄蕊發(fā)育。該模型推斷，F(xiàn)基因的產(chǎn)物控制乙烯在黃瓜植株分布的部位和濃度，促進雌性的表達；而M基因的產(chǎn)物則控制乙烯信號的識別，在乙烯濃度高于閾值時抑制雄蕊的發(fā)育。近年來的研究發(fā)現(xiàn)對該模型提供了實驗支持：F基因已被克隆，為乙烯合成酶基因家族成

3、員之一，符合其控制乙烯濃度功能的預(yù)測；M位點直接介導(dǎo)了乙烯誘導(dǎo)的雄蕊滯育。要進一步驗證該模型的真實性，必須要克隆M基因，而M基因的精細定位則是該基因克隆的前提。 本研究以近等基因系WI1983G(雌性株，基因型為MMFF)和WI1983H(兩性花株，基因型為mmFF)、F1、F2和BC1為材料，通過M基因的精細定位以及轉(zhuǎn)錄表達譜分析，為圖位克隆M基因、研究其功能奠定基礎(chǔ)。而后者又為進一步深入了解乙烯在黃瓜性別表達過程的作用機理，

4、揭示葫蘆科作物性別表達的進化史，乃至通過基因工程操縱其它作物的性別表達來加速雜種優(yōu)勢的利用提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下： 1.近等基因系親本W(wǎng)I1983G全為雌花，WI1983H全為兩性花，它們的雜交組合F1代群體單株均開單性雌花(性型表現(xiàn)為雌性株)，單性花對兩性花為顯性性狀。該雜交組合的F2代群體單株的性型分離株數(shù)統(tǒng)計表明：638株F2單株當(dāng)中，其中雌性株473株，兩性花株165株，經(jīng)卡平方測驗，F(xiàn)2代雌性株與兩性花株的比例符合

5、3:1的分離比(X2=0.38；p>0.5)；BC1代群體751個單株當(dāng)中，雌性株373株，兩性株378株，符合1:1的分離比(X2=0.03；p>0.95)，表明兩性花是由單基因控制。 2.采用高通量AFLP技術(shù)，共獲得4個與M基因緊密連鎖的AFLP分子標記，其中PGGMCCC450/453和PGTMCTA-185分別位于M基因的兩側(cè)，共跨度約5 cM。離M基因最近的側(cè)翼標記EACAMCAT_202/203和EATGMCAA3

6、80與M基因的遺傳距離分別是0.9和1.6 cM，最終將M基因定位在2.5 cM以內(nèi)。 3.利用M基因的側(cè)翼標記PGGMCCC_450/453和PGTMCTA_185，從1984株F2和751個BC1分離群體中篩選出重組單株，然后通過896對AFLP引物組合、2000對SSR引物(來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所功能基因組實驗室黃瓜基因組項目)及CAPS(根據(jù)黃瓜基因組項目Superscaff序列信息)篩選分析，共獲得了AFL

7、P標記6個、SSR標記8個、SCAR標記2個和CAPS標記1個，從而構(gòu)建了M基因的精細遺傳圖譜。M基因側(cè)翼最近的兩個標記SSR23487和S ME8SA7與M基因之間的遺傳距離均為0.1cM，最終將M基因定位在0.2 cM的遺傳區(qū)間內(nèi)。另外，通過染色體步移法開發(fā)出了一個SNP標記SN1，該標記在2，080個F2和751個BC1分離群體當(dāng)中沒有發(fā)生重組事件，也即SN1與M基因共分離。 4.對近等基因系(WI1983G和WI1983

8、H)的雌花和兩性花cDNA分別進行EST測序，其中雌花199，032條，兩性花176，139條。經(jīng)Phred/Phrap/Consed軟件包聚類拼接后共獲得一致性序列(contig)23，627條，雌花和兩性花的單一序列(singlet)分別是32,521和33，494條。經(jīng)Blast比對(Nr非冗余數(shù)據(jù)庫)、IDEG.6分析軟件的卡平方檢驗，發(fā)現(xiàn)1，256個Unigene的表達量在雌花和兩性花間存在顯著性差異(p<0.05).這些差異

9、表達基因涉及到物質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及脅迫相關(guān)等諸多方面。此外，還有一些基因功能未知。 對雌花和兩性花間表達差異顯著的1，256個Unigene進行功能注釋和GO分類。它們被注釋的基因為435個，按照GO分類結(jié)果如下：細胞組分，108條，占36％，主要涉及到細胞核、細胞膜、線粒體等6類組分；分子功能，155條，占51％，表現(xiàn)出7類分子活性；生物學(xué)過程，39條，占13％，涉及到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成、代謝等過程。 以近等