家蠶眠性主基因(M)的精細(xì)定位及候選基因的表達(dá)分析.pdf

1、就眠蛻皮是家蠶幼蟲的一種重要生理現(xiàn)象,家蠶眠性性狀主要受第6連鎖群上的眠性主基因M控制,此外還受到許多修飾基因及環(huán)境條件的影響。本研究應(yīng)用高分辨率熔解分析(HRM)技術(shù)篩選具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記,進(jìn)行眠性主基因的定位,進(jìn)而應(yīng)用RACE技術(shù)克隆候選基因,并對(duì)候選基因的表達(dá)進(jìn)行檢測,以期找出控制家蠶眠性的主基因。
　　本研究取得的主要進(jìn)展如下:
　　(1)HRM技術(shù)用于家蠶SSR分子標(biāo)記基因型鑒定可行性
　　理論上HRM技

2、術(shù)可以鑒定單個(gè)堿基的基因型多態(tài)性,為了優(yōu)化和確定適合于家蠶基因組SSR分子標(biāo)記的HRM分析的技術(shù)參數(shù),并驗(yàn)證熔解曲線多態(tài)性產(chǎn)生的機(jī)制,我們選擇實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)頻率較高的3種典型熔解曲線多態(tài)性的多態(tài)性標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行回收克隆測序,并進(jìn)行CLUSTALW比對(duì)。
　　結(jié)果表明,應(yīng)用HRM分析技術(shù)篩選出的標(biāo)記多態(tài)性的產(chǎn)生機(jī)制多數(shù)是序列長度多態(tài)性和單堿基多態(tài)性的綜合作用。研究結(jié)果驗(yàn)證了HRM技術(shù)應(yīng)用于家蠶SSR標(biāo)記基因型分析的可行性和可靠性。

3、　　(2)家蠶眠性主基因M的定位
　　本研究采用四眠蠶品種大造(p50,+M/+M)與三眠蠶品種C3白(M3/M3)構(gòu)建BC1M回交群體p50×(C3白×p50),選擇其中的598頭三眠蠶個(gè)體作為定位群體,應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術(shù)進(jìn)行家蠶基因組SSR標(biāo)記基因型分析,對(duì)M基因進(jìn)行精細(xì)定位。通過HRM篩選與M基因連鎖的多態(tài)性SSR標(biāo)記,繪制出遺傳總距離為2.4cM的精細(xì)分子標(biāo)記連鎖圖,標(biāo)記S2853-2527和S2853

4、-2843緊鄰M基因兩側(cè),遺傳距離分別是0.2cM和0.7cM,M基因位于家蠶基因組nscaf2853:2,527,929～2,843,864之間,其間有4個(gè)預(yù)測基因,都屬于序列特異的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,推測眠性主基因的作用方式可能與此有關(guān)。
　　(3)候選基因3’RACE
　　在M基因的精細(xì)定位的基礎(chǔ)上,結(jié)合家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫,根據(jù)候選基因的預(yù)測CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物,利用RACE技術(shù)快速擴(kuò)增獲得定位區(qū)間4個(gè)候選基因的

5、cDNA3’端序列。
　　針對(duì)BGIBMGA006391-TA基因進(jìn)行3’RACE,在p50品系中得到1個(gè)序列(p50_6391),在C3白品系中得到2個(gè)序列(C3白_6391-1,C3白_6391-2)。C3白_6391-1是BGIBMGA006391-TA的正確產(chǎn)物,具有完整的3’端。C3白_6391-2序列可能是BGIBMGA006392-TA的產(chǎn)物,具有完整的3’端。
　　針對(duì)BGIBMGA006393-TA基因進(jìn)行

6、3’RACE,在p50品系中得到1個(gè)序列(p50_6393),具有完整的3’端,長度為1038bp。
　　針對(duì)BGIBMGA006394-TA基因進(jìn)行3’RACE,在p50品系中得到2個(gè)克隆產(chǎn)物(p50_6394-1,p50_6394-2),在C3白品系中得到1個(gè)克隆產(chǎn)物(C3白_6394)。p50_6394-1是BGIBMGA006394-TA的正確產(chǎn)物。p50_6394-2基因序列經(jīng)BC1M回交定位群體HRM分型驗(yàn)證確認(rèn)該序列

7、不屬于第6連鎖群。C3白_6394不是BGIBMGA006394-TA,是距離BGIBMGA006394-TA基因約80K的位置上存在的另外1個(gè)共有保守序列的同源基因。
　　(4)候選基因的表達(dá)分析
　　本研究根據(jù)候選基因3’RACE的結(jié)果,采用熒光定量RT-PCR技術(shù),對(duì)四眠品系p50和三眠品系C3白兩個(gè)品系中5個(gè)不同基因在幼蟲期不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量進(jìn)行了檢測分析。
　　從各個(gè)基因的表達(dá)譜的變化與就眠蛻皮、p50與C

8、3白品系間眠性差異的關(guān)聯(lián)性分析,p50_6391、C3白_6391-1、C3白_6391-2的表達(dá)量的變化動(dòng)態(tài)與幼蟲期的就眠蛻皮及眠性均未能發(fā)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)性,可以認(rèn)為預(yù)測基因BGIBMGA0006391-TA與眠性性狀無關(guān)。
　　p50_6393基因的表達(dá)模式在三眠蠶的1齡與四眠蠶的1-2齡相似,三眠蠶的2-3齡與四眠蠶的3-4齡相似。四眠蠶品種3-4齡的高表達(dá)、三眠蠶品種2-3齡的高表達(dá)與終齡的決定似乎有一定的關(guān)聯(lián)。
　　C3