家蠶虎斑基因(Ze)的定位與表達(dá)譜分析.pdf

1、家蠶(Bombyxmori)在中國具有5000年的歷史,是野桑蠶馴化而來的完全變態(tài)昆蟲,不僅是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,也是鱗翅目昆蟲的模式生物。研究家蠶生命過程中的各種表征、功能基因及其分子機(jī)制是對家蠶進(jìn)行完全利用使其經(jīng)濟(jì)利益最大化的重要前提。另一方面由于家蠶與鱗翅目昆蟲具有高度同源性,家蠶在分子水平上的研究成果也可以作為認(rèn)識其他重要鱗翅目昆蟲的功能性狀發(fā)生機(jī)理提數(shù)據(jù)來源,為害蟲的防治及種間特異性防治靶點(diǎn)的選擇提供新的思路和方法。
　　家

2、蠶的斑紋是家蠶最直觀的的體態(tài)特征,且種類繁多。家蠶斑紋的研究不僅可以了解其在分子水平上的發(fā)生機(jī)制,在斑紋限性育種,害蟲防治方面也有深遠(yuǎn)的意義。本實(shí)驗采用家蠶虎斑斑紋為實(shí)驗材料,結(jié)合應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)、HRM分析技術(shù)和差異基因表達(dá)分析等對家蠶虎斑斑紋的精細(xì)定位、發(fā)生機(jī)理和形成機(jī)制進(jìn)行研究。其研究內(nèi)容和主要成果如下:
　　一、家蠶虎斑斑紋基因定位材料的配制
　　本實(shí)驗所用家蠶品種為純合虎斑品系Zebra和純合非虎斑品系p50,

3、均保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所?；咂废礪ebra的基因型為ZeZe,p50的基因型+Ze+Ze,表型為非虎斑。
　　利用家蠶雌不交換的特點(diǎn),由Zebra作為母本,p50品系為父本和回交親本,組配BC1M群體p50×(Zebra×p50)。收集親本、F1及BC1M群體中的非虎斑個體為實(shí)驗材料,置-25℃低溫冰箱保存,以備分子標(biāo)記多態(tài)性篩選和精細(xì)定位使用。
　　二、家蠶虎斑斑紋的精細(xì)定位
　　本研究采用HRM分析技術(shù)對

4、目標(biāo)基因Ze進(jìn)行定位分析。利用479個BC1M非虎斑表型個體作為作圖群體,用篩選得到的9個多態(tài)性標(biāo)記(s2924-06、s2924-11、s2924-08、s2924-60、s2924-03、s2924-01、s2930-09、s2930-16、s2930-22)進(jìn)行家蠶虎斑Ze基因的定位分析。采用Mapmaker3.0作圖軟件,取重組值(LOD)為3.0,繪制出家蠶虎斑基因連鎖圖,所得到的虎斑基因的連鎖圖的遺傳距離為10.7cM,虎斑

5、位于連鎖圖譜遺傳距離6.4cM。得到了2個與虎斑基因較近的SSR標(biāo)記為s2924-01、s2930-09,與Ze的距離分別為1.5cM和0.2cM。
　　三、家蠶虎斑與非虎斑基因的表達(dá)譜分析
　　利用虎斑品系Zebra與非虎斑品系大造(p50)作為回交品系構(gòu)建的近等基因系,以此為3眠眠中的幼蟲體壁為材料,入眠至蛻皮前每個2h取材1次。分別選擇其中虎斑表型個體和非虎斑個體的第3、4腹足中間處截斷,去尾部,剩下的體壁作為虎斑體壁

6、材料和非虎斑體壁材料,抽提總RNA,委托上海翰宇生物科技有限公司進(jìn)行Solexa數(shù)字表達(dá)譜測序。測序得到的reads的平均長度均為100bp。家蠶虎斑材料數(shù)據(jù)(Reads)6059501個,其中有效數(shù)據(jù)(Cleandata)5723324個。測序得到非虎斑材料數(shù)據(jù)為6012510個,其中有效數(shù)據(jù)5654368個。將虎斑與非虎斑的基因進(jìn)行表達(dá)差異分析,發(fā)現(xiàn)虎斑對非虎斑樣品中共有303個基因出現(xiàn)了顯著差異,其中189個為上調(diào)差異,114個為

7、下調(diào)差異。這303個顯著差異基因中有83個基因與家蠶已知功能基因?qū)?yīng)。在189個顯著下調(diào)基因中共有37個基因有對應(yīng)的KO分類,下調(diào)差異表達(dá)基因涉及翻譯、轉(zhuǎn)錄、折疊、分揀、碳水化合物代謝、核苷酸代謝等,但較多的差異表達(dá)基因未能在代謝途徑中得到注釋,所以我們并沒有得到家蠶虎斑非虎斑3眠期間下調(diào)基因的顯著富集的代謝途徑;在114個顯著上調(diào)基因中共有23個查到了對應(yīng)的KO分類,上調(diào)差異表達(dá)基因涉及內(nèi)分泌和代謝疾病、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育等較多,同樣由于

8、較多的差異表達(dá)基因沒有在代謝途徑中得到注釋,所以沒有得到家蠶虎斑非虎斑3眠期間上、下調(diào)基因的顯著富集的代謝途徑。而后,我們對家蠶斑紋色素形成的相關(guān)氨基酸的代謝通路中的差異基因進(jìn)行分析,主要有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸代謝通路差異基因分析,3種氨基酸代謝通路中均有不同基因不同程度的上下調(diào),其中最為顯著的是在酪氨酸代謝通路中編碼酪氨酸羥化酶的基因EC:1.14.16.2(ref|NP_001138794.1|)顯著上調(diào),其基因的主要功能是編碼