自然流產(chǎn)CTB與EVT的基因表達(dá)譜分析.pdf

1、目的：滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮蛻膜的有控性侵襲是胚胎著床和早期發(fā)育過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，這一環(huán)節(jié)的順利完成依賴于各種基因表達(dá)的精確調(diào)控。本研究借助基因芯片技術(shù)，分析自然流產(chǎn)胚胎的CTB和EVT基因表達(dá)譜，篩選二者差異表達(dá)基因，并結(jié)合代謝通路分析，探討異常妊娠EVT侵襲的分子基礎(chǔ)，為闡明自然流產(chǎn)的發(fā)病原因及其基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1)收集妊娠8～12周自然流產(chǎn)的胚胎絨毛和子宮蛻膜組織，胰酶消化法獲得CTB和EVT

2、。 2)提取流產(chǎn)CTB和EVT的總RNA，檢測(cè)RNA純度和完整性。 3)RNA送上海生物芯片公司建立基因表達(dá)譜芯片，獲得基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。 4)分析數(shù)據(jù)，獲取差異表達(dá)基因。 5)選取兩個(gè)差異表達(dá)基因KISS1和MMP10，用RT-PCR和免疫組化法驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠性。 6)結(jié)合代謝通路分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，并對(duì)基因進(jìn)行分類檢索。 結(jié)果： 1)RNA純度及完整性分析，A260.

3、280達(dá)到1.9～2.1，28SRNA和18SRNA電泳條帶清晰，亮度之比約為2:1，表明所抽提的RNA達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。 2)采用不同濃度胰蛋白酶消化方法，獲得了高純度的CTB和EVT。 3)建立了流產(chǎn)CTB和EVT的基因表達(dá)譜芯片，質(zhì)控合格。RT-PCR驗(yàn)證KISS1和MMP10表達(dá)與芯片結(jié)果一致，證實(shí)芯片結(jié)果可靠。 4)在CTB和EVT基因表達(dá)譜芯片中，共篩選到2308個(gè)差異表達(dá)基因(或EST)，聚類分析結(jié)果顯

4、示上調(diào)基因933個(gè)，下調(diào)基因1375個(gè)。所有差異表達(dá)基因按GeneOntoloty功能分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了功能檢索分類。 5)綜合分析不同生物學(xué)功能類別的2308個(gè)差異表達(dá)基因，共檢索到代謝相關(guān)基因上調(diào)307個(gè)、下調(diào)391個(gè)；細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因上調(diào)29個(gè)、下調(diào)5個(gè)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)54個(gè)、下調(diào)153個(gè)；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因上調(diào)87個(gè)、下調(diào)58個(gè)；細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)基因上調(diào)36個(gè)、下調(diào)78個(gè)；凋亡相關(guān)基因上調(diào)13個(gè)、下調(diào)41個(gè)；物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基

5、因上調(diào)62個(gè)、下調(diào)80個(gè)；應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)30個(gè)、下調(diào)53個(gè)；免疫應(yīng)答相關(guān)基因上調(diào)12個(gè)、下調(diào)112個(gè)；細(xì)胞黏附相關(guān)基因上調(diào)37個(gè)、下調(diào)53個(gè)；發(fā)育相關(guān)基因上調(diào)58個(gè)、下調(diào)55個(gè)。此外，通過檢索，我們發(fā)現(xiàn)有539個(gè)基因尚無功能描述，其中上調(diào)209個(gè)、下調(diào)296個(gè)。 結(jié)論： 建立了流產(chǎn)CTB和流產(chǎn)EVT的全基因組表達(dá)譜芯片，并獲取差異表達(dá)基因2308個(gè)，其中一些是目前還沒有報(bào)道生物學(xué)功能或在胚胎發(fā)育中無相關(guān)報(bào)道的新基因

6、，同時(shí)印證了當(dāng)前已經(jīng)報(bào)道和自然流產(chǎn)發(fā)生相關(guān)的基因。 綜合分析不同生物學(xué)功能類別的差異表達(dá)基因表達(dá)變化，提示可能存在以下一些調(diào)節(jié)機(jī)制：與正常妊娠相比，在自然流產(chǎn)中，細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，如MMP-1、MMP-2、MMP-9，MMP-10等基因下調(diào)明顯，表明在自然流產(chǎn)中這些基因所涉及的EVT識(shí)別、黏附、降解細(xì)胞外基質(zhì)，侵入血管內(nèi)皮使母體血管重建等功能都呈降低的趨勢(shì)；在自然流產(chǎn)蛻膜中，免疫應(yīng)答和細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)

7、下調(diào)，可能導(dǎo)致免疫細(xì)胞對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性識(shí)別而引起殺傷活性增高，使得母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎產(chǎn)生排斥，這可能是引發(fā)自然流產(chǎn)的又一重要因素；眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生改變，總體趨勢(shì)還是促使細(xì)胞向增殖期轉(zhuǎn)變，發(fā)生增殖和分化，有序地形成功能不同的組織和系統(tǒng)，以維持胎兒的早期發(fā)育；細(xì)胞生長(zhǎng)/維持和發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)旺盛，是適應(yīng)胚胎細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和各系統(tǒng)器官形成的需要；與正常妊娠基因表達(dá)譜相比較，自然流產(chǎn)的基因芯片中物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)的上