水稻光敏核不育基因pms1的精細(xì)定位以及候選基因區(qū)段序列分析.pdf

1、光敏核不育水稻由于具有長(zhǎng)日照條件下不育而短日照條件下可育的特性，既可作不育系，又可作保持系，是發(fā)展水稻“兩系”法育種的重要種質(zhì)資源。眾多生理生化和遺傳學(xué)方面的研究都表明光敏雄性不育是一個(gè)十分復(fù)雜的現(xiàn)象。迄今為止，人們對(duì)光敏核不育現(xiàn)象具體作用機(jī)理知之甚少。因此，本研究從分子水平入手，分離克隆控制水稻光敏雄性不育性的基因，設(shè)法闡明光敏核不育水稻雄性不育和育性轉(zhuǎn)換的機(jī)理。這無(wú)論是對(duì)植物雄性不育發(fā)生機(jī)理的豐富，還是對(duì)尋找培育優(yōu)良雄性不育系的新途

2、徑，都具有重要的意義。此前研究表明，根據(jù)不同雜交組合遺傳背景的差異，農(nóng)墾58S的不育性受到1個(gè)或2個(gè)主效位點(diǎn)的控制，位于水稻第七染色體上的prosl位點(diǎn)在絕大多數(shù)雜交組合中都能檢測(cè)得到。利用水稻秈型不育組合32001S/明恢63，pmsl被定位在RFLP標(biāo)記RG477和R1807之間，分別距離0.5 cM和3.8cM，物理圖譜的構(gòu)建、BAC克隆測(cè)序以及進(jìn)一步精細(xì)定位將基因框定在BAC克隆2109上2個(gè)SSR標(biāo)記之間，并完成了該區(qū)段微物理

3、圖譜的構(gòu)建。本研究的主要內(nèi)容及其結(jié)果為： 1．從農(nóng)墾58 BAC文庫(kù)篩選得到克隆18P4并進(jìn)行shotgun文庫(kù)構(gòu)建、亞克隆測(cè)序和拼接，最終得到長(zhǎng)度為81，029 bp的外源序列，與克隆2109重疊55,046 bp。 2．對(duì)2109的序列進(jìn)行修正和注釋，其上總共有13個(gè)預(yù)測(cè)基因，預(yù)測(cè)的編碼區(qū)和可轉(zhuǎn)座子成份分別占BAC總長(zhǎng)度的28.3％和31.0％，進(jìn)一步比較認(rèn)定候選區(qū)段7個(gè)預(yù)測(cè)基因中的5個(gè)是pmsl的重要候選基因，可以

4、進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。 3．以pmsl區(qū)段粳稻品種日本晴和農(nóng)墾58以及秈稻品種93-11和明恢63的基因組序列為材料進(jìn)行共線性研究，它們?cè)诨蛩缴暇哂休^好的共線性，而在基因間隔區(qū)差異比較大，并且這種差異主要來(lái)源于LTR-retrotransposons的插入和缺失；93-11與農(nóng)墾58之間的多態(tài)性最高而明恢63和93-11之間的最低，亞種間的多態(tài)性總體上比亞種內(nèi)的高，但日本晴和農(nóng)墾58之間的多態(tài)性比農(nóng)墾58和明恢63之間的還高

5、，而且該區(qū)段DNA的多態(tài)性比全基因組平均水平要高得多；進(jìn)一步對(duì)LTR-retrotransposons插入時(shí)間進(jìn)行估計(jì)證實(shí)了pmsl區(qū)段從秈粳分化以來(lái)經(jīng)歷了一個(gè)非?？焖俚倪M(jìn)化過(guò)程。 4．對(duì)以前所有轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行育性考查和分子表記分析未能找到表型與分子標(biāo)記相關(guān)性很好的家系，而進(jìn)一步對(duì)1個(gè)光形態(tài)建成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)也未能得到預(yù)期結(jié)果，初步斷定pmsl可能不在該區(qū)段。 5．構(gòu)建農(nóng)墾58S/明恢63近等基因系，從1個(gè)大約220

6、0株的BC2F3群體中獲得了500株極端雄性不育單株，利用SSR標(biāo)記ch743和ch745進(jìn)行初篩，獲得了50個(gè)極端不育重組單株；以大量的亞克隆作探針對(duì)親本進(jìn)行分析發(fā)展了一系列可用標(biāo)記，進(jìn)一一步的標(biāo)記分析將基因確定在Rssr和5C1aG8之間；結(jié)合以前的定位數(shù)據(jù)，初步斷定基因在Rssr和H1/N2之間。 6．對(duì)BAC克隆57N1和24L2進(jìn)行了序列測(cè)定，24L2的外源全長(zhǎng)119,695 bp，57N1的外源全長(zhǎng)89,893 bp

7、，最終2109、57N1和24L2這3個(gè)克隆連成一個(gè)大的contig，全長(zhǎng)290,641 bp。比較發(fā)現(xiàn)日本晴和明恢63基因組序列在該區(qū)段存在大片段的缺失和插入，從而導(dǎo)致Rssr與5C1aG8之間的物理距離在明恢63和日本晴基因組上分別為109 kb和242 kb。與缺失和插入相關(guān)的片段是一些LTR-retrotransposons以及幾個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因。兩個(gè)品種在Rssr與5C1aG8之間大約重疊85 kb并有8個(gè)預(yù)測(cè)基因，而其中5個(gè)位

8、于Rssr和N685之間21kb的區(qū)段，這說(shuō)明后者是一個(gè)基因富集區(qū)和重要功能區(qū)，另外，H1/N2和N685之間沒(méi)有預(yù)測(cè)基因；綜合以上信息，基因最終被確定在Rssr和N685之間。 7．生物信息學(xué)分析表明，Rssr和N685之間有5個(gè)預(yù)測(cè)基因，其中3個(gè)在擬南芥中能找到高度同源蛋白。以pCAMBIA 1301為載體，將5段相互重疊的明恢63 DNA片段導(dǎo)入到農(nóng)墾．58S中并獲得了大量轉(zhuǎn)基因植株，其中片段ulpl的拷貝數(shù)在T<,0>代