甘藍型油菜隱性核不育恢復基因BnMS2的精細定位與候選基因鑒定.pdf

1、油菜是我國主要的油料作物,而雜種優(yōu)勢利用又是提高油菜產(chǎn)量、緩解產(chǎn)量與品質(zhì)之間矛盾、增強品種抗(耐)逆性的一條有效途徑。油菜隱性細胞核雄性不育具有不育性徹底穩(wěn)定、細胞質(zhì)來源豐富、恢復源廣等優(yōu)點,在國內(nèi)已經(jīng)成為雜種優(yōu)勢利用的一個重要途徑,但在雜交制種時需人工拔除母本行中50％的可育株,限制了其廣泛應用。隱性細胞核雄性不育材料S45A的不育性受兩對重疊隱性基因控制(潘濤等,1988),S45B的BnMs1位點處于雜合狀態(tài),而Brims2位點處

2、于隱性純合狀態(tài)。本研究以S45A和育性正常的普通甘藍型油菜IL362-2-4為材料通過兩親本的雜交、自交、兄妹交及等位性分析構(gòu)建了在BnMs2位點分離的近等基因系S4516AB,在此基礎上對隱性核不育基因BnMs2進行了精細定位,克隆和轉(zhuǎn)基因研究,一方面為雄性不育的選育提供分子標記,另一方面以期加深對雄性不育機理的認識。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.對S4516B和S45B的雜合位點進行等位性分析,為S4516AB定位群體的確立

3、打下了基礎。通過對NIL系S4516AB的育性調(diào)查結(jié)果表明,兄妹交后代的育性分離比為1:1,可育株自交后代的育性比例符合3:1,說明S4516B為單位點雜合,結(jié)合等位性分析的結(jié)果證實了兩型系S4516AB的基因型,不育株S4516A為Bnms1Bnms1Bnms2bnms2,可育株S4516B為Bnms1Brims1BnMs2Bnms2。
　　 2.利用AFLP結(jié)合BSA的分析方法,通過篩選1024對AFLP引物組合找到了與Bn

4、Ms2連鎖的AFLP標記12個,在262株的NIL分離群體中對BnMs2進行了初步定位,將目標基因鎖定在3.5cM內(nèi),另外8個AFLP標記與BnMs2共分離。
　　 3.對12個AFLP標記回收克隆測序后,用PCR walking分離了8個共分離標記的側(cè)翼序列,延長后的標記序列長度在815-2661bp之間,并成功轉(zhuǎn)化了5個SCAR標記,其中2個為共顯性標記。繼續(xù)在2650株的不育大群體中采用改良的混合樣品作圖法和側(cè)翼分子標記分

5、析法對BnMs2進行精細定位,將8個在小群體中共分離的標記定位在BnMs2兩側(cè)1.OcM區(qū)域內(nèi),其中最近標記Lm10和Lm11距目標基因分別只有0.038cM和0.075cM。
　　 4.通過圖譜定位將與BnMs2連鎖的4個標記整合到2個DH群體(Tapidor×Ningyou7和Quantum×No.2127-17)的連鎖群上,成功將BnMs2定位到甘藍型油菜C基因組N16染色體上。并在TN群體的N16連鎖群上找到1個共顯性的

6、SSR標記Nal2A05。
　　 5.延伸后的標記序列與擬南芥進行同源性比較,在擬南芥第1條染色體下方找到一個包含121個擬南芥基因的共線性區(qū)域?；跀M南芥基因組信息及網(wǎng)上大量蕓苔屬EST、GSS、BAC序列信息,開發(fā)了1個ACGM標記B14,同時Lm10經(jīng)1個白菜BAC為橋梁被定位在擬南芥基因Atlg69510和Atlg69520之間。B14和Lm10將BnMs2在擬南芥上的候選基因縮小到12個。由于.BnMs2和BnMs1功

7、能相同,都可以恢復S45A和S4516A不育株的育性,而本定位研究篩選出的12個候選基因又包括BnMs1的2個候選基因,因此BnMs2基因也必在BnMs1的2個候選基因中,將這2個BnMs2的候選基因命名為BnG1和BnG2。
　　 6.對2個候選基因BnG1、BnG2分別構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達載體p2301G1和p2301G2進行互補測驗,以S4516AB為外植體通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化均獲得了轉(zhuǎn)基因陽性株。在7株BnG1的轉(zhuǎn)化株中,

8、S4516A沒有能恢復育性；在3株BnG2的轉(zhuǎn)化株中,也沒有發(fā)現(xiàn)S4516A育性恢復。
　　 7.根據(jù)BnMs1和BnG2基因cDNA5’端的保守序列構(gòu)建反義表達載體192301AntiG2,通過轉(zhuǎn)基因?qū)estar中的BnMs1和BnG2進行反義抑制,獲得了20株陽性株,對其中12株在花期進行育性檢測沒有發(fā)現(xiàn)預期的不育表型。
　　 8.構(gòu)建候選基因BnG2啟動子的GUS融合基因表達載體p121P2GUS,對目標基因啟動