水稻光敏雄性核不育基因pms3的精細(xì)定位.pdf

1、光敏感雄性核不育水稻農(nóng)墾58S具有長日高溫不育、短同低溫可育的特點，是發(fā)展水稻“兩系”法育種的重要種質(zhì)資源。此自的研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)雜交組合中材料遺傳背景的不同，農(nóng)墾58S的不育性受到1個或2個位點的控制，位于第12染色體上的pms3位點是導(dǎo)致正常水稻品種農(nóng)墾58突變?yōu)楣饷粜坌圆挥巨r(nóng)墾58S的根源。利用只在pms3基因位點發(fā)生育性分離的農(nóng)墾58S／DH80 F<，2>群體，pms3基因已被精細(xì)定位到兩個RFLP分子標(biāo)記C751和M36之

2、間，距離分別為1.6 cM。 本研究的最終目的是遵循圖位克隆法的策略，分離克隆pms3基因。通過對農(nóng)墾58S／DH80 F<,2>群體進行擴大，從大約7000株的F<,2>群體中獲得了892株極端．雄性不育單株，利用C751和M36進行RFLP分析，分別獲得了極端不育重組單株43株和17株用于對pms3基因的精細(xì)定位。根據(jù)美國Clemson大學(xué)基因組研究所釋放的日本晴全基因組物理圖譜信息，找到了可能覆蓋pms3基因區(qū)域的同本晴B

3、AC重疊群，結(jié)合DNA指紋技術(shù)和分子標(biāo)記對60株重組單株的分析，確定了包含13個BAC克隆在內(nèi)的pms區(qū)段物理圖譜。 通過利用157個BAC克隆的亞克隆作為探針對親本農(nóng)墾．58S和DH80進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)了4個來自不同BAC克隆的與pms3基因緊密連鎖的分子標(biāo)記P9、135、C11和M2，利用這4個標(biāo)記對C75l和M36篩選出的重組單株進行基因型分析，發(fā)現(xiàn)M2和P9將目標(biāo)基因限定到兩個相互重疊的BAC克隆73M2和71J16

4、上。采用“鳥槍”法對可能攜帶pms3基因的BAC克隆73M2進行測序，獲得了約160 kb的基因組序列，通過搜索Monsanto公司的數(shù)據(jù)庫，得到了另外108 kb的序列，將該區(qū)域的序列延伸至268 kb，同時結(jié)合對亞克隆P9和M2的序列測定，將目標(biāo)基因限定到230 kb的范圍內(nèi)。在230 kb范圍每隔5 kb左右挑選1個亞克隆作為探針，共49個探針對親本進行分析，找到了11個在親本間有多態(tài)性的亞克隆，利用它們作為探針繼續(xù)分析該區(qū)間重組

5、事件發(fā)生的情況，將pros3基因范圍縮小至兩個分子標(biāo)記LJ25和LK40之間，二者相距28.4 kb，與pms3基因之間分別還有4個和2個重組單株。該28.4 kb DNA片段上包含了l在水稻花和成熟葉片中表達(dá)的基因、1個在愈傷組織和早期的幼穗中表達(dá)的基因以及5個預(yù)測的ORFs。 為了進行pms3基因的功能互補測驗以及比較農(nóng)墾58、DH180、農(nóng)墾58S之間序列上的差異，以農(nóng)墾58葉片為材料，構(gòu)建了農(nóng)墾58基因組BAC文庫，該文

6、庫包含克隆24576個，平均插入片段大小約70 kb，覆蓋水稻基因組4.4倍。利用73M2和71J16篩選該文庫，獲得了覆蓋LJ25和LK40之問區(qū)域的農(nóng)墾58 BAC克隆117H5并進行了測序：對農(nóng)墾58S、DH80中同源區(qū)域的DNA片段進行了PCR擴增并測序；三者序列比較發(fā)現(xiàn)了1個存在于可育親本農(nóng)墾58、DH80與不育親本農(nóng)墾58S之間的SNP。 pms3功能互補測驗以農(nóng)墾58為供體，農(nóng)墾58S為受體，構(gòu)建了5個轉(zhuǎn)化載體，將