薩羅羅非魚(Sarotherodon melanotheron)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)及其雜交后代耐鹽相關(guān)基因的研究.pdf

1、薩羅羅非魚是一種耐鹽性極強(qiáng)的羅非魚品種，自然分布于西非從象牙海岸到塞內(nèi)加爾的港灣、瀉湖等廣大水域。尼羅羅非魚新吉富品系是在吉富的基礎(chǔ)上群體選育而成的新品種，耐鹽性弱，在淡水中具有生長(zhǎng)速度快的優(yōu)點(diǎn)。兩者在分類上不同屬，自然條件下不能交配，為了充分利用我國(guó)豐富的咸、海水資源，本研究室通過(guò)人工繁殖獲得雜交后代，具有較好的生長(zhǎng)速度和較強(qiáng)的耐鹽性能的優(yōu)點(diǎn)。Na+-K+-ATPase酶alpha1亞基(NKAa1)、Na+/K+-2Cl共轉(zhuǎn)運(yùn)子1

2、alpha亞基(NKCC1a)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1b亞基(IGF-Ⅰb)和催乳素-Ⅰ基因(PRL-Ⅰ)等是與耐鹽滲透調(diào)節(jié)密切相關(guān)的基因，本文以薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及其雜交F1為實(shí)驗(yàn)材料，在耐鹽性能比較的基礎(chǔ)上，對(duì)上述四個(gè)基因的序列組成、分子結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄后mRNA表達(dá)差異進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，以期對(duì)薩羅羅非魚、尼羅羅非魚的耐鹽遺傳機(jī)理進(jìn)行有益的探索，為耐鹽羅非魚新品種的選育和推廣提供必要的理論支持。主要研究結(jié)果如下:
　　一薩羅、

3、尼羅及雜交F1耐鹽性能的比較
　　以薩羅羅非魚、尼羅羅非魚、雜交F1及雜交F2為實(shí)驗(yàn)材料，從淡水零鹽度開始，實(shí)驗(yàn)組每天提高水體8個(gè)鹽度，直到實(shí)驗(yàn)魚全部死亡，對(duì)四種遺傳型羅非魚的累積存活率(CS)和50％死亡鹽度(MLS)進(jìn)行比較，結(jié)果表明:(1)經(jīng)過(guò)15天的慢性耐鹽實(shí)驗(yàn)，薩羅羅非魚的MLS約為125.78±1.66，尼羅羅非魚的MLS約為54.22±2.51，雜交F1和F2的MLS值分別約為77.33±1.89和73.73±1.3

4、2。薩羅羅非魚耐鹽性能顯著高于尼羅羅非魚及雜交后代，而雜交后代耐鹽性能也顯著高于尼羅羅非魚，雜交F1與F2之間的耐鹽性能沒有顯著差異。(2)薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及雜交后代第一尾魚死亡的鹽度分別為96、40和56，到最后一尾魚死亡時(shí)鹽度分別為136，80和96，間隔時(shí)間分別為6天、5天和5天。
　　二薩羅、尼羅及雜交F1 NKAa1基因克隆、序列分析及mRNA表達(dá)差異
　　根據(jù)GenBank中莫桑比克羅非魚的NKAa1基因序

5、列設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及雜交F1 NKAa1基因的部分保守序列，根據(jù)所獲得的序列，設(shè)計(jì)了6對(duì)RACE引物，分別進(jìn)行3'RACE擴(kuò)增和5'RACE擴(kuò)增，得到薩羅羅非魚、尼羅羅非魚、雜交F1 NKAa1基因cDNA全長(zhǎng)序列;設(shè)計(jì)一對(duì)qRT-PCR引物，用SYBR熒光染料檢測(cè)其mRNA表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)薩羅羅非魚、尼羅羅非魚、雜交F1 NKAa1基因cDNA序列全長(zhǎng)分別為3227bp、3257b

6、p和3223bp，薩羅羅非魚和尼羅羅非魚核苷酸相似度為95.76％，與雜交F1相似度為97.73％，而尼羅羅非魚與雜交F1相似度為93.92％。開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為3072bp，編碼1023個(gè)氨基酸，薩羅羅非魚與雜交F1的氨基酸相似度為98.3％，尼羅羅非魚與薩羅羅非魚及雜交F1氨基酸相似度均為97.65％。(2)聚類分析表明雜交F1 NKAa1基因比較偏向于薩羅羅非魚。(3)薩羅羅非魚Ser519不同于尼羅羅非魚和雜交F1，導(dǎo)致

7、該位點(diǎn)附近NKAa1基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變;薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及雜交F1 NKAa1基因含8個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(TM)，其中TM1～4和TM7～8在所有同源物種中的分布都非常保守，但是TM5～6的分布差異較大，尼羅羅非魚F916和T917兩個(gè)氨基酸殘基的突變，可能是其跨膜螺旋分布差異的原因。(4)淡水條件下，NKAa1基因在尼羅羅非魚肝臟中的表達(dá)量最高，在腸道中表達(dá)量最低;而薩羅羅非魚鰓、腸、腎中表達(dá)量顯著的高于肝，雜交F1也是

8、腸道中表達(dá)量最低，但是差異不顯著;在致死鹽度下，尼羅羅非魚鰓和腸組織中NKAa1 mRNA表達(dá)量顯著上升，而肝組織和腎組織中表達(dá)量則顯著下降，薩羅羅非魚鰓中NKAa1 mRNA的表達(dá)受鹽度影響極其顯著，致死鹽度下鰓NKAa1表達(dá)量(19.821±3.951)接近為淡水條件下表達(dá)量(1.054±0.185)的20倍，雜交F1鰓肝腸腎中表達(dá)量均隨著鹽度上升而增加，但是差異不顯著。
　　三薩羅、尼羅及雜交F1NKCC1a基因克隆、序列分

9、析及mRNA表達(dá)差異
　　Na-K-2Cl1alpha亞基是維持鰓絲氯細(xì)胞滲透壓平衡的關(guān)鍵離子轉(zhuǎn)運(yùn)器，以1Na+∶1K+∶2Cl-的比例進(jìn)行電中性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。本文關(guān)于NKCC1a基因的研究結(jié)果如下:(1)從薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及雜交F1鰓絲組織中分離出NKCC1α基因cDNA全長(zhǎng)序列，全長(zhǎng)分別為3832bp、3819bp和3827bp，其開放閱讀框長(zhǎng)3456bp，編碼1151個(gè)氨基酸殘基。多重比對(duì)和聚類分析結(jié)果表明，本研究獲得的基

10、因序列與莫桑比克羅非魚、鮭及鰻鱺的NKCC1α最為相似，其中，與莫桑比克羅非魚相似性最高(＞99％)。(2)預(yù)測(cè)薩羅羅非魚、尼羅羅非魚和雜交F1的NKCC1α蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)包含10個(gè)跨膜螺旋，這些跨膜螺旋的氨基酸序列及其分布在所有硬骨魚類中都非常保守。(3)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)鰓、肝、腸、腎NKCC1αmRNA相對(duì)含量，淡水條件下，薩羅羅非魚鰓中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于肝、腸和腎中的表達(dá)量;尼羅羅非魚和雜交F1

11、是腎臟中相對(duì)表達(dá)量最高，差異極其顯著;鹽度顯著影響NKCC1α在薩羅羅非魚、尼羅羅非魚和雜交F1鰓組織中的表達(dá)，在致死鹽度下NKCC1αmRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為0鹽度下的4.9倍、13.9倍和8.8倍，差異極顯著(P＜0.001)，顯示NKCC1α基因與三種遺傳型羅非魚耐鹽適應(yīng)密切相關(guān)。(4)在腸組織中，尼羅羅非魚的NKCC1a基因mRNA相對(duì)表達(dá)量隨鹽度增加而顯著升高，雜交F1則恰好相反，結(jié)果說(shuō)明在高滲環(huán)境中它們可能具有不同的滲透壓

12、調(diào)節(jié)機(jī)制，尼羅羅非魚更接近淡水魚類的調(diào)節(jié)模式。(5)薩羅羅非魚與雜交F1三個(gè)突變氨基酸殘基位點(diǎn)S252、L398和M409導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)與尼羅羅非魚不一致，可能與三者的耐鹽差異有關(guān)。
　　四薩羅、尼羅及雜交F1IGF-Ⅰb基因克隆、序列分析及mRNA表達(dá)差異
　　應(yīng)用3' RACE克隆技術(shù)，分別從薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及雜交F1的鰓的總RNA中獲得其IGF-Ⅰb基因的部分cDNA序列，對(duì)三種遺傳型羅非魚的IGF-Ⅰb基因的研

13、究結(jié)果表明:(1)IGF-Ⅰb基因序列長(zhǎng)度分別為1076bp、1075bp和1079bp，包含完整的開放閱讀框(ORF)546bp、一個(gè)終止密碼及含polyA信號(hào)的3'UTR，尚缺5'UTR序列;其ORF編碼182個(gè)氨基酸，包括信號(hào)肽(44aa)，成熟肽B區(qū)(29aa)、C區(qū)(10aa)、A區(qū)(21aa)、D區(qū)(8aa)及編碼70aa的E區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析為混合類型。(2)同源基因多重比對(duì)表明，三種遺傳型羅非魚的IGF-Ⅰb基因與其他脊椎

14、動(dòng)物IGF-Ⅰb基因序列的相似度達(dá)75.8％～100％。成熟肽A、B區(qū)高度保守，C區(qū)第82位后缺失2aa， E區(qū)第131位和159位分別缺失3aa和1aa;(3)薩羅羅非魚在E肽133位發(fā)生Ala/Pro氨基酸殘基替換，與耐鹽性強(qiáng)的莫桑比克羅非魚和畫眉羅非魚一致，推測(cè)IGF-Ⅰb基因E區(qū)選擇性剪切與三種羅非魚耐鹽性能差異有關(guān)。(4)淡水條件下，薩羅羅非魚、尼羅羅非魚和雜交F1 IGF-Ⅰb基因都是主要在肝臟中表達(dá)，但是在致死鹽度下，耐鹽

15、性弱的尼羅羅非魚腸道中含量最高，且極顯著的高于淡水零鹽度下表達(dá)量，而鰓、肝、腎中相對(duì)含量均顯著降低;雜交F1和耐鹽性強(qiáng)的薩羅羅非魚在致死鹽度下鰓中的含量均顯著升高，但是雜交F1肝、腸、腎中含量均顯著降低。
　　五薩羅、尼羅及雜交F1 IPRL-Ⅰ基因克隆、序列分析及mRNA表達(dá)差異
　　采用常規(guī)基因克隆和RACE相結(jié)合，從薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及雜交F1鰓組織中得到PRL-Ⅰ基因cDNA部分序列，對(duì)三種遺傳型羅非魚的PRL-

16、Ⅰ基因編碼區(qū)的序列結(jié)構(gòu)及mRNA表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明:(1)本研究得到薩羅羅非魚、尼羅羅非魚及雜交F1的PRL-Ⅰ部分cDNA核苷酸序列分別為1444bp、1449bp和1499bp，包括較短的5'UTR序列、保守的編碼區(qū)和比較長(zhǎng)的3'UTR序列。開放閱讀框序列長(zhǎng)639bp，編碼212個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼(TAA)，編碼區(qū)包括信號(hào)肽(24aa)和成熟肽(188aa)。(2)序列比對(duì)顯示薩羅羅非魚與雜交F1的ORF組成完全一致，二者與

17、尼羅羅非魚氨基酸相似度為99.5％，尼羅羅非魚第2號(hào)（R2）和第46號(hào)(S46)殘基發(fā)生突變，可能與它們的耐鹽性能差異有關(guān)。(3)成熟肽的4個(gè)半胱氨酸殘基在所有物種中都高度保守，同源比對(duì)結(jié)果顯示，E29、M132、K140和L186等四個(gè)氨基酸殘基為羅非魚魚類的特異性殘基。(4) PRL-Ⅰ基因在鰓、肝、腸、腎組織中都有表達(dá)，淡水條件下尼羅羅非魚腸中的含量最低，但是與其它三種組織中的表達(dá)量相比差異不顯著;而薩羅羅非魚以肝和腸中含量最高，