尼羅羅非魚性腺過表達(dá)IGF3及其可能結(jié)合蛋白的初步研究.pdf

1、胰島素樣生長因子系統(tǒng)(Insulin-like Growth Factor system,IGF system)是一類進(jìn)化上比較保守的信號(hào)通路。該系統(tǒng)參與調(diào)控細(xì)胞的存活、分化、遷移以及增殖,同時(shí)對(duì)個(gè)體的生長、發(fā)育、成熟和代謝都具有重要作用。在哺乳動(dòng)物中,胰島素樣生長因子系統(tǒng)由2個(gè)配體(IGF1,IGF2)、2個(gè)受體(IGF1R,IGF2R)、6個(gè)結(jié)合蛋白(IGFBP1-6)組成。眾所周知,配體需要與受體結(jié)合才能發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能;結(jié)合

2、蛋白則通過內(nèi)分泌、旁分泌或者自分泌的方式延長配體生活周期調(diào)節(jié)配體的生物學(xué)功能。近年來,本實(shí)驗(yàn)室在硬骨魚類克隆了胰島素樣生長因子家族的一個(gè)新成員—IGF3(Insulin-like growth factor3),它僅在性腺表達(dá)。初步研究表明IGF3可能在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)性腺分化、發(fā)育、成熟和生殖周期中具有重要作用。本研究擬通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)IGF3來初步研究其在性腺發(fā)育過程中的生物學(xué)功能,并對(duì)性腺中

3、表達(dá)的IGFBP進(jìn)行系統(tǒng)研究,以期尋找IGF3相應(yīng)的結(jié)合蛋白。
　　 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因過表達(dá)載體plRES-hrOFP-1a-IGF3,顯微注射1細(xì)胞時(shí)期的XX基因型受精卵。待孵化后120天提取83條轉(zhuǎn)基因魚基因組DNA并用pIRES-hrGFP-1a載體特異性引物篩選出6條陽性轉(zhuǎn)基因魚,陽性率為7.2%。熒光體式顯微鏡下觀察到性腺表達(dá)的綠色熒光蛋白,通過組織學(xué)(HE染色)觀察性腺看到類似顆粒細(xì)胞樣的體細(xì)胞大量增生,同時(shí)伴隨有同步化分

4、裂現(xiàn)象。
　　 目前在哺乳動(dòng)物中只有6個(gè)IGFBP,而硬骨魚類由于發(fā)生了一次特有的基因組復(fù)制,所以IGFBP基因家族應(yīng)該是12個(gè)。但實(shí)際上本研究從尼羅羅非魚中只得到11個(gè)IGFBP,分別命名為IGFBP1α、IGFBP1b、IGFBP2α、IGFBP2b、IGFBP3α、IGFBP3b、IGFBP4、IGFBP5α、IGFBP5b、IGFBP6α、IGFBP6b。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明:硬骨魚類中只存在一個(gè)IGFBP4,這可能是由于進(jìn)

5、化過程中復(fù)制基因發(fā)生了次生性丟失;基因編碼序列分析發(fā)現(xiàn),所有IGFBP均是由四個(gè)外顯子組成。IGFBPs成熟肽序列均由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:保守的N-、C-結(jié)構(gòu)域以及不保守的L結(jié)構(gòu)域。通過RT-PCR對(duì)8月齡尼羅羅非魚IGFBPs進(jìn)行組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)IGFBP2α、IGFBP3α、IGFBP3b、IGFBP4、IGFBP5α和IGFBP5b均在性腺中有表達(dá)。同時(shí)采用Real-Time PCR對(duì)IGFBPs(2α,3α、3b,4,5α,5b)進(jìn)

6、行性腺發(fā)育過程中(孵化后5天到70天)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn):IGF3和IGFBP3b、IGFBP5α的表達(dá)模式相似;在孵化后10天的IGFBP2α,孵化后20天的IGFBP2α、3α、4表達(dá)存在明顯的性別差異,且在XY性腺中的表達(dá)量顯著高于XX。同時(shí)對(duì)孵化后5、30、90、180天XX和XY性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析不僅證實(shí)了以上結(jié)果,還發(fā)現(xiàn)IGFBP1a、IGFBP1b以及IGFBP6b也在孵化后30天的性腺中有表達(dá)。原位雜交結(jié)果顯示:IGF3和

7、IGFBP3b、IGFBP5α在精巢Leydig細(xì)胞中共表達(dá);同時(shí)發(fā)現(xiàn),IGFBP3α在卵巢和精巢的體細(xì)胞表達(dá),IGFBP4在卵母細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞以及精巢的間質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)IGFBP5b在Leydig細(xì)胞中有表達(dá),而IGFBP2α在精巢的精子細(xì)胞表達(dá)。
　　 綜上所述,卵巢過表達(dá)IGF3會(huì)影響性腺的生長和發(fā)育,這些結(jié)果表明IGF3可能對(duì)卵巢的生長和發(fā)育具有重要作用。本研究得到了11個(gè)尼羅羅非魚IGFBP,其中IGFBP2