Rln3a在尼羅羅非魚(yú)精子發(fā)生過(guò)程的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、松弛素家族在生殖學(xué)領(lǐng)域受到關(guān)注，哺乳類RLN3是一種新型的松弛素家族成員，在腦和睪丸中表達(dá)。迄今為止，關(guān)于RLN3生物學(xué)功能的報(bào)道，主要作為一種神經(jīng)肽參與腦部的神經(jīng)調(diào)節(jié)：如應(yīng)激反應(yīng)、激勵(lì)、主動(dòng)性、調(diào)節(jié)攝食活動(dòng)等。小鼠的RLN3基因敲除導(dǎo)致其焦躁不安，憂慮多動(dòng)，因而RLN3長(zhǎng)期以來(lái)作為一種神經(jīng)肽，治療神經(jīng)疾病，如抑郁癥等。硬骨魚(yú)類出現(xiàn)了rln3復(fù)制基因：rln3a和rln3b，其中rln3a是脊椎動(dòng)物中rln3的直系同源基因，本課題組的前

2、期研究基礎(chǔ)表明rln3a在羅非魚(yú)腦和精巢中有較高的表達(dá)水平，但迄今為止未見(jiàn)關(guān)于rln3參與脊椎動(dòng)物生殖調(diào)控的報(bào)道。為了揭示rln3a在硬骨魚(yú)類精子發(fā)生過(guò)程中的作用，本研究以尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)計(jì)了一系列的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明。羅非魚(yú)是重要的世界性養(yǎng)殖魚(yú)類，它的性別決定類型是XX和XY型，其單性魚(yú)苗很容易獲得，我們實(shí)驗(yàn)室已完成對(duì)羅非魚(yú)性別分化不同發(fā)育時(shí)期（孵化后5、30、90、180天）雌雄性腺的

3、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，深入研究了類固醇激素（11-KT和DHP）、生長(zhǎng)因子（IGF3和AMH等）、轉(zhuǎn)錄因子（Dmrt1和Sf1等）對(duì)羅非魚(yú)精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)控，建立了羅非魚(yú)的基因敲除平臺(tái)，這些工作使得羅非魚(yú)成為研究硬骨魚(yú)類育性的良好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在本研究中，我們?cè)讷@得rln3a突變F0代個(gè)體的基礎(chǔ)上，篩選到F1代rln3a的突變個(gè)體，深入研究該基因突變影響精巢分化、精子發(fā)生的分子機(jī)制。首先通過(guò)免疫組化、H.E.染色、流式細(xì)胞儀和電鏡等方法研究了rln3

4、a突變對(duì)精巢組織結(jié)構(gòu)、精子發(fā)生和育性等過(guò)程的影響。其次，分別對(duì)rln3a突變個(gè)體和對(duì)照魚(yú)的腦和性腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，在腦和性腺中篩選出一系列顯著差異表達(dá)基因。最后通過(guò)Real-time PCR和免疫組化驗(yàn)證了rln3a突變前后這些基因在性腺中的表達(dá)模式，闡明了rln3a影響羅非魚(yú)精子發(fā)生的分子機(jī)制。我們得出的研究結(jié)果歸納如下：
　　1）對(duì)已獲得的F0代rln3a基因突變個(gè)體飼養(yǎng)至性成熟，通過(guò)F0代突變雄性個(gè)體與正常雌性個(gè)體受精得

5、到F1代。運(yùn)用H.E.染色對(duì)3月齡F1代rln3a基因突變的羅非魚(yú)個(gè)體進(jìn)行組織學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變個(gè)體的性腺中精子發(fā)生啟動(dòng)延遲，與對(duì)照組相比未發(fā)現(xiàn)初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞等各級(jí)生精細(xì)胞。免疫組化實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到雄激素（Cytochrome P450, family11, subfamily C, polypeptide1，11-KT）合成酶（Cyp11b2）的表達(dá)。另外，通過(guò)抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）染色發(fā)現(xiàn)在rln3a突變的精巢

6、中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組的精巢。因此，我們推測(cè)rln3a基因的突變影響羅非魚(yú)精子發(fā)生的啟動(dòng)和精原細(xì)胞的增殖。
　　2）通過(guò)H.E.染色發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變成魚(yú)的精巢精小葉紊亂，幾乎未見(jiàn)精子細(xì)胞和成熟精子。通過(guò)掃描電鏡發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變個(gè)體的精巢出現(xiàn)空腔，精巢的橫切面積和精子數(shù)量顯著低于對(duì)照組。通過(guò)透射電鏡發(fā)現(xiàn)在rln3a基因突變魚(yú)的性腺中未發(fā)現(xiàn)成熟精子，但與對(duì)照組個(gè)體相比，rln3a基因突變魚(yú)未影響精巢中精母細(xì)胞的分化。<

7、br>　　3）通過(guò)F1代rln3a基因突變成魚(yú)與正常XX個(gè)體受精實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胚胎到受精后2天（囊胚期）幾乎全部死亡，表明rln3a基因突變個(gè)體不能正常受精。分別取rln3a基因突變魚(yú)和正常羅非魚(yú)的精液，用流式細(xì)胞儀和電腦輔助的精子分析儀進(jìn)行相應(yīng)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變個(gè)體的精子體積(FSC)和細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜程度(SSC)顯著低于對(duì)照組。精子活力測(cè)定結(jié)果顯示，rln3a基因突變個(gè)體的精子活力相關(guān)參數(shù)（平均直線、曲線運(yùn)動(dòng)速度、精子活力、精子

8、濃度）顯著低于對(duì)照組。通過(guò)對(duì)血清中激素水平的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，rln3a基因突變個(gè)體血清中11-KT、FSH和LH的水平顯著低于對(duì)照組XY個(gè)體。
　　4）為了進(jìn)一步研究rln3a基因突變對(duì)羅非魚(yú)個(gè)體的影響，我們分別對(duì)rln3a基因突變和對(duì)照組個(gè)體的腦和性腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。在腦和性腺中篩選出rln3a基因突變前后顯著差異表達(dá)的基因，并且對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG的分析。最后通過(guò)Real-time PCR驗(yàn)證了這些基因在rln3a基