Figla在尼羅羅非魚卵巢分化過程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、在哺乳動物中，性別決定和分化是由雄性和雌性特異基因之間的對抗和平衡來實現(xiàn)的。同時，濾泡和卵母細(xì)胞之間的協(xié)調(diào)作用對于卵巢分化也是不可或缺的。原始卵泡是生殖系統(tǒng)中最基本的單位，調(diào)控卵泡和胚胎形成的轉(zhuǎn)錄因子在卵泡生長和發(fā)育過程早期已經(jīng)表達(dá)并發(fā)揮功能，其中Figla是最早表達(dá)的生殖細(xì)胞特異的性轉(zhuǎn)錄因子之一，它對卵泡的早期發(fā)育有重要的調(diào)控作用。研究報道，小鼠的Figla基因最早可以在13.5 d的雌性胚胎的生殖嵴中表達(dá)，且持續(xù)表達(dá)于發(fā)育過程中的卵

2、泡和生殖細(xì)胞簇中，F(xiàn)igla可激活雌性生殖細(xì)胞特異基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育、Zp基因的表達(dá)以及透明帶的形成過程。同時，哺乳動物Figla能夠抑制雄性生殖細(xì)胞特異基因的表達(dá)。眾所周知，尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）是重要的世界性養(yǎng)殖魚類，其單性魚苗易于獲得，因此羅非魚是研究魚類性別決定與分化不可或缺的良好實驗?zāi)Ｐ?。本研究中，通過基因組以及性腺轉(zhuǎn)錄組等生物信息學(xué)手段對羅非魚Figla基因進(jìn)行了分離和鑒定，且做了大

3、量的分析工作;實驗采用real-time PCR和免疫組化等方法來分析羅非魚Figla/Figla的表達(dá)模式;創(chuàng)新性地使用TALENs介導(dǎo)的基因敲除和轉(zhuǎn)基因過表達(dá)兩種方法，從正反兩個方面來開展對Figla基因功能方面的研究工作，以此來闡明Figla在羅非魚卵巢分化中的可能作用和分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1)本研究成功地從尼羅羅非魚卵巢cDNA中獲取Figla開放讀碼框(ORF，Open Reading Frame)，其編碼

4、198個氨基酸。氨基酸同源性比對發(fā)現(xiàn)，羅非魚Figla基因編碼了保守結(jié)構(gòu)域:bHLH，且在魚類進(jìn)化過程中較為保守;系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，羅非魚Figla與其他硬骨魚類的Figla聚為一簇，而其他四足動物的Figla單獨(dú)聚為一簇;通過共線性分析發(fā)現(xiàn)，魚類Figla基因在其上下游都具有較為保守的基因座位，如:HK2，ADD2，SNRNP27，MXD1等基因。而在四足類和哺乳類對應(yīng)染色體的相同部位也發(fā)現(xiàn)了同樣的基因座位。
　　2)分別運(yùn)

5、用real-time PCR和免疫組織化學(xué)等方法檢測了Figla組織分布和個體發(fā)生過程的時空表達(dá)模式。組織分布研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚Figla在卵巢中的表達(dá)水平要明顯高于其它組織。在個體發(fā)生過程中，F(xiàn)igla的表達(dá)水平在孵化后30dah(days after hatching)出現(xiàn)顯著的上升，3 mah(months after hatching)時達(dá)到最高（生殖細(xì)胞減數(shù)分裂啟動的關(guān)鍵時期），4mah時開始下降。利用免疫組化來檢測Figla在

6、羅非魚性腺中的蛋白水平的表達(dá)情況，其檢測結(jié)果與real-time PCR結(jié)果一致，F(xiàn)igla蛋白表達(dá)于3月齡和5月齡羅非魚卵巢的初級卵母細(xì)胞中，然而在精巢中卻檢測不到Figla陽性信號。這些表達(dá)模式表明，F(xiàn)igla可能在羅非魚卵巢的分化和維持中起重要作用。
　　3)利用TALENs靶向基因敲除技術(shù)對Figla基因敲除結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TALENs能高效（約52.5％）地對Figla基因進(jìn)行編輯，利用PCR和測序檢測到包括刪除不同堿基數(shù)目（

7、4、8、20等）的突變類型。此外，3月齡XX的Figla敲除個體出現(xiàn)卵巢發(fā)育異常，表現(xiàn)為卵母細(xì)胞大量或完全缺失，并伴隨體細(xì)胞的大量增生。免疫組化結(jié)果顯示，在Figla基因敲除陽性個體的卵巢中檢測到雄激素(11-KT)合成酶（Cyp11b2）的表達(dá)，但幾乎不能檢測到雌激素(E2)合成酶（Cyp19a1a）的表達(dá)。通過檢測血清激素水平發(fā)現(xiàn)，血清11-KT水平升高，E2水平隨之降低。結(jié)果表明像哺乳動物一樣，在雌性個體中Fig1a基因突變導(dǎo)致大

8、量卵母細(xì)胞退化，同時，原始濾泡向雄性間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
　　4)同時構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因過表達(dá)載體pIRES-hrGFP-1a-Figla，在羅非魚遺傳全雄(XY)個體中過表達(dá)Figla，分析其在雄性性腺發(fā)育過程中的可能作用。對Figla過表達(dá)陽性個體性腺進(jìn)行了常規(guī)的組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其精子發(fā)生過程受到了嚴(yán)重阻礙，具體表現(xiàn)為精巢中減數(shù)分裂的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞受損。Sycp3(synaptonemal complex protein3)和prm

9、(protamine)表達(dá)量急劇下降，也印證了這一事實。盡管Figla過表達(dá)雄魚的支持細(xì)胞（dmrt1）和間質(zhì)細(xì)胞（star和cyp17a1）的標(biāo)志基因的表達(dá)沒有受到影響，但hsd3b1的表達(dá)量卻出現(xiàn)明顯上升?？偟膩碚f，在雄魚中過表達(dá)Figla可抑制精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)。
　　綜上所述，本研究從羅非魚中分離出Figla，序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明它在脊椎動物進(jìn)化過程中較為保守。在XX個體中敲除Figla導(dǎo)致卵巢退化，Cyp11b

10、2表達(dá)量明顯增高，前濾泡細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為Leydig細(xì)胞，與對照組相比，血清11-）KT水平顯著升高，E2水平隨之降低。因此我們推測，F(xiàn)igla在魚類卵巢分化和維持中可能發(fā)揮重要作用。在雄性羅非魚中過表達(dá)Figla導(dǎo)致精子發(fā)生過程嚴(yán)重被破壞。與正常三月齡XY個體相比，過表達(dá)Figla的陽性魚GSI顯著降低，表明其性腺分化和發(fā)育過程受損，性腺形態(tài)嚴(yán)重缺陷進(jìn)一步說明過表達(dá)Figla抑制了精母細(xì)胞分化和精子的成熟。同時，Sycp3和prm表達(dá)量下