尼羅羅非魚性別決定機(jī)制和性別相關(guān)的分子標(biāo)記.pdf

1、尼羅羅非魚已成為世界性的主要養(yǎng)殖對(duì)象之一，研究表明其遺傳性別決定類型為XX/XY型。對(duì)不同遺傳型尼羅羅非魚的有絲分裂中期相染色體進(jìn)行熒光原位雜交表明，在尼羅羅非魚中，X與Y染色體之間存在差異。但是到現(xiàn)在為止，沒有發(fā)現(xiàn)性別特異分子標(biāo)記。遺傳性別的快速鑒定問題是尼羅羅非魚性別控制研究中的一個(gè)難點(diǎn)。本文從DNA水平對(duì)雌雄尼羅羅非魚進(jìn)行比較，研究其性別控制機(jī)理，篩選能區(qū)分雌雄的分子標(biāo)記。主要研究結(jié)果如下： 1.本文參照不同物種DM結(jié)構(gòu)域

2、設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并引物，以尼羅羅非魚精巢RNA為模板，通過RT-PCR方法，擴(kuò)增出一條帶，長約140bp。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，陽性克隆采用SSCP分析篩選不同基因片段，進(jìn)一步對(duì)篩選的不同基因進(jìn)行了DNA測序。結(jié)果獲得2個(gè)不同的 Dmrt 基因，與GenBank 聯(lián)機(jī)，采用 BLAST 方法與人類相應(yīng) DMRT 基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與人類相應(yīng) DMRT 基因的氨基酸序列一致性分別為：89.1％、100％，顯示出 Dmrt 基因在系統(tǒng)進(jìn)化上具

3、有高度的保守性。根據(jù)尼羅羅非魚的拉丁文名，按習(xí)慣將其命名為onDmrt1，onDmrt2。為了探討Dmrt1和Dmrt2兩個(gè)基因的功能，根據(jù)獲得的序列，分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，采用RT-PCR技術(shù)，對(duì)尼羅羅非魚不同組織Dmrt1和Dmrt2基因的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dmrt2基因在精巢，卵巢，腦，眼，鰓，心臟中都有表達(dá)，暗示Dmrt2基因的功能可能主要是參與器官發(fā)育，而不是性別決定過程。而Dmrt1 只在精巢中特異表達(dá)，在其它組織中無

4、表達(dá)，顯示Dmrt1基因主要在性別決定及性狀維持中有重要功能。根據(jù)擴(kuò)增出的Dmrt1 DM-domain的序列，設(shè)計(jì)上游引物P5，P6，用3‘RACE法從尼羅羅非魚精巢中分離和測定了Dmrt1 cDNA的序列，3'-RACE擴(kuò)增得到1108bp的片段，共編碼262個(gè)氨基酸，奧利亞羅非魚、虹鱒、新月魚、青鯔等動(dòng)物的Dmrt 1的氨基酸序列進(jìn)行比較，同源性分別為：99％，62％，73％，41％。以Dmrt 1基因組序列為基礎(chǔ)，采用Gamie

5、r-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案預(yù)測DMRT1蛋白的B細(xì)胞表位，為精確地研究DMRT1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，從而揭示他們的性別調(diào)控機(jī)能提供參考。 2.參照人SRY基因HMG-box保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增了尼羅羅非魚Sox基因，在雌雄尼羅羅非魚個(gè)體中均擴(kuò)增出五

6、條帶，大小分別約為200 bp，400 bp，600 bp，800 bp，1200bp，回收200bp左右擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，陽性克隆采用SSCP分析，篩選不同基因片段。進(jìn)一步對(duì)篩選的不同基因進(jìn)行DNA測序，結(jié)果獲得了五個(gè)不同的228bp Sox基因，與GenBank聯(lián)機(jī)，采用BLAST 方法與人類相應(yīng) SOX 基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與人類相應(yīng)SOX蛋白的氨基酸序列一致性分別為97.2％、97.2％、94.4％、96％、88.2％，顯示

7、出該基因在分子進(jìn)化上具有高度的保守性。根據(jù)尼羅羅非魚的拉丁文名，按習(xí)慣將其命名為onSox1a、onSox1b、onSox3、onSox4 and onSox12。采用RT-PCR 技術(shù)，研究了尼羅羅非魚精巢、卵巢、腦、眼、鰓和心臟等組織中Sox3基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，Sox3基因在精巢、卵巢、腦和眼中有不同程度表達(dá)，而在鰓和心臟中無表達(dá)，證實(shí)Sox3基因在其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，性腺發(fā)生和功能維持上有著重要功能。本研究為探索尼羅羅非魚的

8、性別決定機(jī)制和Sox基因表達(dá)模式提供了資料。 3.采用RAPD技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚雌、雄各11尾個(gè)體共22個(gè)樣本進(jìn)行性別和遺傳多樣性檢測。從80個(gè)寡聚核苷酸隨機(jī)引物中篩選出17個(gè)擴(kuò)增重復(fù)性好、條帶清晰、特異性強(qiáng)的引物，對(duì)每個(gè)個(gè)體基因組 DNA 進(jìn)行了擴(kuò)增。得到RAPD產(chǎn)物的分子量在200-2000bp之間，產(chǎn)物總計(jì)127個(gè)位點(diǎn)，其中，多態(tài)位點(diǎn)45個(gè)(占35.43％)。計(jì)算個(gè)體間遺傳相似系數(shù)平均為0.8648，個(gè)體間遺傳距離平均為0.

9、1352。用Shannon多樣性指數(shù)量化的遺傳多態(tài)度(H<,0>)，雄性群體(0.1910)高于雌性群體(0.1797)，平均遺傳多態(tài)度(Hpop)為0.1854。尼羅羅非魚遺傳多態(tài)度所占的比例在群體內(nèi)為13.63％，而雌、雄群體間為86.37％。在尼羅羅非魚雌、雄個(gè)體RAPD產(chǎn)物中，電泳圖譜上不能讀出明顯的雄性特征帶。 4.利用 AFLP 技術(shù)，應(yīng)用49個(gè)引物組合，檢測了尼羅羅非魚雌雄基因組 DNA的多態(tài)性，篩選與尼羅羅非魚性

10、別相關(guān)的分子標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)中共擴(kuò)增出 2694 條帶，篩選出候選差異DNA片段748條。挑選出20對(duì)引物進(jìn)行雌雄兩代個(gè)體進(jìn)一步的分析。其中引物E4/M5組合產(chǎn)生1個(gè)大小約為150bp的片段，在所有兩代雄性尼羅羅非魚均出現(xiàn)這一片段，在F1代的15尾雌尼羅羅非魚中有僅有 1 尾出現(xiàn)該片段，對(duì)F2代15尾雌尼羅羅非魚也只有2出現(xiàn)，由此推斷此條帶可能與性別相連鎖。對(duì)該特異擴(kuò)增帶經(jīng)回收和測序，為了將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為重復(fù)性和特異性更好的SCAR標(biāo)記，