蘆筍性別決定基因分子標(biāo)記的篩選與開(kāi)發(fā).pdf

1、蘆筍(Asparagus officinalis L.)是一種深受消費(fèi)者喜愛(ài)的營(yíng)養(yǎng)保健型高檔蔬菜,具有“蔬菜之王”的美譽(yù)。蘆筍雌雄異株,性別是由位于同型性染色體L5上的一對(duì)等位基因(M-m)控制,雄性M-,雌性mm。其雄株因不結(jié)種子消耗養(yǎng)分少,產(chǎn)量比同期生長(zhǎng)條件的雌株高出25％以上,且壽命長(zhǎng),抗性強(qiáng),為此全球正在大力開(kāi)展蘆筍全雄育種。蘆筍超雄株(MM)與雌株雜交后代全部為雄株(Mm)(MM×mm→Mm),此過(guò)程稱之為全雄育種,超雄株的篩

2、選是蘆筍全雄育種的關(guān)鍵。然而,超雄株與普通雄株即使在開(kāi)花期表型上也沒(méi)有任何差異,且蘆筍從播種到開(kāi)花大約需要2年時(shí)間,若利用與蘆筍性別決定基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記輔助選擇,苗期快速準(zhǔn)確篩選出超雄株,可加快蘆筍全雄育種進(jìn)程,提高育種效率。本研究利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間多態(tài)性(ISSR)、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)等DNA分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合群體分離分析方法(BSA)對(duì)蘆筍性別決定基因連鎖的DNA.分子標(biāo)記進(jìn)行篩選、轉(zhuǎn)化研究,這些標(biāo)記的獲得與

3、轉(zhuǎn)化將有助于蘆筍性別(包括超雄株)早期快速鑒別和性別決定基因的定位研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.首先進(jìn)行了蘆筍基因組DNA的改良CTAB法、SDS法和試劑盒提取方法的比較研究。結(jié)果表明:以蘆筍嫩綠的擬葉為試驗(yàn)材料,經(jīng)改良CTAB法提取的DNA完整性好、濃度和純度都比較高,綜合效果優(yōu)；加入2％PVP和0.1％的巰基乙醇可以去除多糖、多酚類物質(zhì)和防止褐化現(xiàn)象的發(fā)生；在蘆筍兩性現(xiàn)象調(diào)查的基礎(chǔ)上,利用兩性株自交雌雄分離群體S1代,

4、通過(guò)群體分離分析法(BSA),構(gòu)建4對(duì)B23(Thielim),B24(Grolim),B25(Backlim),B33(Guelph Millenium)雌雄分離后代的DNA池和1770(MM)以及雜交后代品種G190-1(mm),總共5對(duì)DNA池進(jìn)行性別連鎖標(biāo)記的篩選研究；
　　 2.利用單因素分析方法優(yōu)化了蘆筍基因組的ISSR反應(yīng)條件,得出較優(yōu)的ISSR反應(yīng)條件是:25μL反應(yīng)體系中,基因組DNA50ng,引物5μmol/

5、L2μL,dNTP200μmol/L2μL,10×buffer2.5μL,Mg2+25mmol/L2.5μL,Taq酶1U；反應(yīng)程序是94℃預(yù)變性5min；32個(gè)循環(huán)中變性94℃1min,48℃～53℃復(fù)性1min,72℃延伸1min；最后72℃延伸10min:
　　 3.利用構(gòu)建好的5個(gè)品種內(nèi)的雌雄DNA池作為材料進(jìn)行ISSR分析,篩選和檢測(cè)到ISSR3引物在所有5對(duì)雌雄DNA池間具有多態(tài)性,獲得2條多態(tài)性片段,克隆測(cè)序；結(jié)果

6、表明:Asp_1全長(zhǎng)為778bp,編碼4個(gè)ORF；Asp_2全長(zhǎng)是993bp,編碼6個(gè)ORF。經(jīng)Blastn比對(duì),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同源相關(guān)序列,是新開(kāi)發(fā)的蘆筍基因組序列；
　　 4.單株驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Asp1和Asp2與性別決定基因連鎖,根據(jù)Asp1測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物,將Asp1轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的標(biāo)記SCAR15'-ATTGCGAGCATTGTAATCTTCTTC-3’,R:5'-TTGTCATTGGATAGGGAGT-3’),SCAR

7、2(F:5'-TCATTGGATAGGGTTGGAGTCGG-3’,R:5'-TGTG-CATTTCATCACCTCGGTCT-3’),SCAR1能夠在蘆筍基因組上穩(wěn)定擴(kuò)增,與蘆筍性別決定基因連鎖,并表現(xiàn)為共顯性,共顯性標(biāo)記SCAR1的獲得將有助于蘆筍超雄株(MM)的快捷篩選,經(jīng)初步雌雄分離單株驗(yàn)證得出準(zhǔn)確率是83％；而SCAR2在雌雄群體中都能擴(kuò)增出來(lái),可作為蘆筍特異性標(biāo)記；根據(jù)Asp_2測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物,將Asp_2轉(zhuǎn)化

8、為更穩(wěn)定的標(biāo)記SCAR3(F:5'-TACCCCGTATCTTCTGGTGAGTG-3’;R:5'-CGAGTTTTGTGATTCTTTGTGGC-3’),通過(guò)在5對(duì)DNA池和12株雌雄單株中驗(yàn)證,SCAR3在雄株DNA中穩(wěn)定擴(kuò)增,與蘆筍性別決定基因連鎖,經(jīng)初步雌雄分離單株驗(yàn)證得出準(zhǔn)確率是90％。
　　 5.建立了蘆筍基因組DNA的SRAP反應(yīng)體系:25μL的反應(yīng)體系中,模板DNA量80ng、Mg2+濃度3.0mmol/L、上下

9、游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer;擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3min,反應(yīng)前5個(gè)循環(huán)在94℃30s、35℃30s、72℃1.5min的條件下運(yùn)行；隨后的35個(gè)循環(huán)退火溫度提高到50℃；最后72℃延伸10min。得出6％變性聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物效果比瓊脂糖檢測(cè)分辨率高,適合進(jìn)行SRAP擴(kuò)增差異片段分析；
　　 6.利用該優(yōu)化體系進(jìn)行了256對(duì)SRAP引物篩選

10、,從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰豐富、重復(fù)性好的引物組合239個(gè),占整個(gè)引物序列的93.36％;回收了引物組合ME3+EM12在品種B23雌雄DNA池內(nèi)200～500bp間具有多態(tài)性的擴(kuò)增差異條帶Asp-3,測(cè)序得出序列長(zhǎng)度為307bp,經(jīng)Blastn分析為蘆筍新的基因組序列,并將 ME3+EM12引物對(duì)轉(zhuǎn)化成了 SCAR4(F:5'-CCTGTTCCGTTTACTTAGGACAATC-3’,R:5'-GGGTATTATTTGGAGAAGGTG