杜仲EST-SSR標(biāo)記開發(fā)與性別鑒定.pdf

1、杜仲為雌雄異株木本植物，具有重要的藥用價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。杜仲的利用價(jià)值因其植株性別而異，包括杜仲膠等次生代謝產(chǎn)物在雌雄植株中均存在差別，而從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法在杜仲開花前難辨別雌雄株性別，需要7年以上開花后才能確定。為了加強(qiáng)對(duì)杜仲資源的有效保護(hù)和可持續(xù)利用，深入分析杜仲遺傳多樣性研究、遺傳結(jié)構(gòu)和鑒別杜仲雌雄株性別，本研究基于杜仲雌雄株轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫研究開發(fā)了SSR標(biāo)記，取得如下研究結(jié)果:
　　1杜仲雌雄株轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中SSR發(fā)掘及特征

2、分析
　　基于杜仲雌雄株轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫Unigenes序列，利用MISA軟件進(jìn)行SSRs序列查找及其特征分析，發(fā)掘了74230個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在61629條Unigenes中，占總Unigenes的33.99％，其中，12~24 bp長(zhǎng)度的重復(fù)基序最多，基序重復(fù)次數(shù)以11~15次居多；重復(fù)基序種類主要以一、二、三重復(fù)基元類型為主，占總數(shù)的98.6%，其中出現(xiàn)最多的3種重復(fù)類型分別為：A/T(73.16%)、AG/CT(10.91%

3、)、AAG/CTT(1.14%)。
　　2優(yōu)化杜仲SSR-PCR反應(yīng)體系
　　采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化SSR-PCR反應(yīng)體系，獲得的最優(yōu)SSR-PCR體系為：20μL體系中含2×Premix Taq酶(0.05μmol·min-1·μL-1)10μL、DNA模板(25 ng·μL-1)1μL，引物(10μmol·L-1)0.5μL，以ddH2O補(bǔ)足。
　　3引物篩選及有效性檢測(cè)
　　用1份杜仲資源檢驗(yàn)引物

4、擴(kuò)增效果、優(yōu)化各引物的擴(kuò)增條件，從210對(duì)引物中篩選獲得140對(duì)引物，成功用于杜仲基因組 PCR的有效擴(kuò)增，占66.66%，進(jìn)一步以9個(gè)地區(qū)的10份杜仲資源，檢驗(yàn)上述引物多態(tài)性，最終獲得15個(gè)穩(wěn)定、可重復(fù)的多態(tài)性SSR位點(diǎn)，上述位點(diǎn)共檢測(cè)到57個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)包含3.8個(gè)等位基因，雜合度(Ho)為0~1.0，期望雜合度(He)為0.28~0.78，多態(tài)信息量(PIC)為0.26~0.70，平均值為0.44。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，該15個(gè)S

5、SR位點(diǎn)都含有預(yù)期的重復(fù)基序序列。
　　4貴州杜仲栽培群體遺傳多樣性及親緣關(guān)系的SSR分析
　　本研究應(yīng)用15個(gè)SSRs標(biāo)記分析了貴州杜仲栽培群體的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，12個(gè)群體295個(gè)體共檢測(cè)到76個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為3-10，其均值為5.067；每個(gè)群體的等位基因數(shù)na、期望雜合度He、Shannon指數(shù)I的平均值分別為4.011、0.533和0.996，多態(tài)位點(diǎn)百分率PPL除LL群體和QNY群體為93.

6、3％外，其余10個(gè)群體的PPL都為100％，說明貴州杜仲群體具有較高的遺傳多樣性；湄潭群體MT和龍里群體LL的固定指數(shù)（F）平均值為負(fù)值，其余都為正值，表明群體內(nèi)的雜合子缺失，群體內(nèi)存在近親繁殖現(xiàn)象；群體間的遺傳分化系數(shù)FST為0.0660，遺傳變異主要分布在群體內(nèi)；UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)，聚類分組并未按地區(qū)位置而聚類，這可能是在栽培過程中人為選擇的結(jié)果，貴陽花溪群體與其他11個(gè)群體的遺傳距離最大，興義群體和仁懷群體的遺傳距離最近。本研

7、究為杜仲的遺傳保護(hù)、種質(zhì)資源收集提供建議。
　　5杜仲雄性特異標(biāo)記的開發(fā)
　　利用來源于7個(gè)產(chǎn)地的杜仲雌雄植株各6份DNA樣品篩選引物，PCR擴(kuò)增獲得具性別差異的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆及序列分析，應(yīng)用雌雄植株各12份DNA樣品檢驗(yàn)性別標(biāo)記的可靠性。從140對(duì)EST-SSR引物中篩選出一對(duì)引物EST-Eu059，在雌、雄植株中產(chǎn)生差異條帶，雌、雄植株均有一條約160bp的序列(分別命名為Eu-f160和Eu-m160)，