高溫處理后尼羅羅非魚性逆轉(zhuǎn)雄魚與未逆轉(zhuǎn)雌魚的差異性腺轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、動(dòng)物性別決定一直以來(lái)是生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它對(duì)個(gè)體的發(fā)育和自然種群性別比例組成等都具有深刻的影響。依據(jù)性別決定因素，性別決定模式可分為遺傳性別決定（Genotypic Sex Determination,GSD）和溫度性別決定（Temperature-dependent Sex Determination,TSD）兩類。魚類的性別決定模式介于遺傳性別決定（GSD）和溫度性別決定（TSD）之間，也稱為GSD+TE（Temperature

2、 Effect）類型，即在性腺分化期溫度變化能部分影響魚類的性別決定。尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）是一種性別分化方向受到基因和溫度雙重影響的魚類，即在尼羅羅非魚的性別分化期，溫度能夠?qū)ζ湫詣e分化的方向起到一定的導(dǎo)向作用，而溫度是如何影響其性別分化，以及尼羅羅非魚性腺分化早期的高溫處理對(duì)其性腺發(fā)育的影響如何，具體的分子機(jī)制是什么，目前還不是很清楚。
　　本研究通過偽雄魚和野生型雌魚交配的方式建立3個(gè)尼羅羅

3、非魚全雌家系，三個(gè)家系高溫處理后的性逆轉(zhuǎn)率分別為90.4％、86%和74%。我們挑取雄性率最高的家系分別利用HE染色和Illumina Hiseq技術(shù)對(duì)受精后120天全雌家系（對(duì)照組）和高溫處理組雌雄尼羅羅非魚性腺進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)和高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。組織學(xué)結(jié)果顯示高溫處理后的雌魚卵母細(xì)胞排列松散，高溫處理后的雄魚性腺和正常野生型雄魚相似，沒有顯著變化。將測(cè)序所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與尼羅羅非魚基因組進(jìn)行比對(duì)，對(duì)照組雌魚（CF）、高溫處理組雌魚（TF

4、）、高溫處理組雄魚（IM）共獲得149624210 Raw Reads，共有124515460 Clean Reads，平均有80.09%Clean Reads比對(duì)到尼羅羅非魚基因組上。CF、TF和IM三組間兩兩比較，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因（DEG）上、下調(diào)數(shù)目分別為：CF/TF共有DEG79個(gè)，其中上調(diào)DEG34個(gè)，下調(diào)DEG45個(gè)；CF/IM共有DEG11117個(gè)，其中上調(diào)DEG5779個(gè)，下調(diào)DEG5338個(gè)；TF/IM共有DEG1

5、1000個(gè)，其中上調(diào)DEG5607個(gè)，下調(diào)DEG5393個(gè)。Venn圖顯示CF/TF和CF/IM、CF/TF和TF/IM、CF/IM和TF/IM共有的DEG分別為54、44和9451個(gè)。將CF/TF DEG按照不同差異倍數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有很多差異倍數(shù)大于7的差異基因。另外將所獲得的DEG分別通過COG、NR、KEGG、GO和Swiss Prot注釋，其中GO分析將DEG分為三類，分別為Cellular Component（CC），Mol

6、ecular Function（MF）和Biological Process（BP）。另外還在Ovarian steroidogenesis,Cell cycle,GnRH signaling pathway,Natural killer cell-mediated cytotoxicity等生物學(xué)通路中鑒定出許多DEG。
　　本研究接著對(duì)鑒定出的性類固醇激素合成相關(guān)基因和溫度響應(yīng)相關(guān)基因，利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，共驗(yàn)證了10

7、個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)雄性激素合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)如hsd17b7、3β-hsd，雌性合成相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)如cyp19a1a。并且短暫性腺分化早期的高溫處理持續(xù)影響了cyp19a1a、pycrl、mrpl28、cdc42和ccnh基因。為了進(jìn)一步檢測(cè)短暫性腺分化早期的高溫處理對(duì)雌激素合成關(guān)鍵基因cyp19a1a的持續(xù)性影響，本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的cyp19a1a表達(dá)載體，誘導(dǎo)原核表達(dá)cyp19a1a蛋白，利用親和層析技術(shù)純化蛋白，用其免疫8周齡

8、昆明白小鼠獲得多克隆抗體。利用Western blot檢測(cè)高溫處理后cyp19a1a蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫處理后cyp19a1a蛋白在TF和IM中均表達(dá)顯著下調(diào)。
　　總之，本研究結(jié)果顯示了高溫處理導(dǎo)致尼羅羅非魚雌魚卵母細(xì)胞排列疏松，對(duì)于雄魚沒有顯著影響；顯著下調(diào)了雌激素合成基因，顯著上調(diào)了雄激素合成基因，并持續(xù)影響了卵巢分化和發(fā)育重要基因cyp19a1a相關(guān)基因、溫度響應(yīng)基因和一些核受體基因的表達(dá)水平。初步證明了性激素合成代