尼羅羅非魚(yú)Dmrt1、Amh和Cypllb2抗體制備及其在正常發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)性腺中的表達(dá)研究.pdf

1、性別決定和性別分化是脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育的兩個(gè)關(guān)鍵事件，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子和性類固醇激素，如Dmrtl、Amh、雌激素等。同樣作為性類固醇激素的雄激素卻不參與性別決定，而是與精子發(fā)生有著密切的關(guān)系。Dmrt1(Doublesexandmab-3relatedtranscriptionfactor1)是DM家族成員之一，是迄今發(fā)現(xiàn)的從無(wú)脊椎動(dòng)物到人最保守的與性別決定相關(guān)的基因，它所編碼的蛋白質(zhì)包含一個(gè)具有DNA結(jié)合能力的保守基序，即D

2、M結(jié)構(gòu)域。Amh(Anti-MüllerianHormone)是一種糖蛋白，屬于TGF-β超家族,誘導(dǎo)雄性哺乳動(dòng)物繆勒氏管的退化。真骨魚(yú)類雖然沒(méi)有繆勒氏管，但仍然有Amh表達(dá)，那么，它在真骨魚(yú)類性別分化中發(fā)揮怎樣的作用，還有待研究。真骨魚(yú)類雄激素11-酮基睪酮(11-KT)合成所必需的關(guān)鍵酶是Cyp11b2(11β-hydroxylase)，它直接催化睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)?1β-羥基睪酮，后者再由11β-HSD催化形成11-KT。真骨魚(yú)類雌激素合

3、成所必需的關(guān)鍵酶是Cyp19a1a(aromatase)，它直接催化睪酮形成雌二醇。Dmrt1、Amh和Cyp11b2在真骨魚(yú)類性腺發(fā)育中均有重要作用，在尼羅羅非魚(yú)也有相應(yīng)研究，但因缺乏相應(yīng)的抗體，導(dǎo)致其蛋白水平的研究幾乎無(wú)法開(kāi)展。故本研究制備了尼羅羅非魚(yú)Dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗體，并對(duì)其在正常和性逆轉(zhuǎn)尼羅羅非魚(yú)性腺中蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了初步研究。
　　 尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)具

4、有生長(zhǎng)速度快、性成熟時(shí)間短、繁殖周期短等特點(diǎn)，因此，它是研究性別決定及分化的好材料。且本實(shí)驗(yàn)室具有成熟的獲得尼羅羅非魚(yú)全雄、全雌魚(yú)苗及人工誘導(dǎo)其性逆轉(zhuǎn)（外源雌激素可誘導(dǎo)XY雄魚(yú)向雌魚(yú)逆轉(zhuǎn)，外源雌激素合成酶抑制劑可誘導(dǎo)XX雌魚(yú)向雄魚(yú)逆轉(zhuǎn)）技術(shù)，取材方便快捷，故本實(shí)驗(yàn)選擇羅非魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　 本研究利用RT-PCR擴(kuò)增出完整的Dmrt1、Amh和Cyp11b2ORF(openreadingframe)，將其連接進(jìn)pColdⅠ表

5、達(dá)載體中進(jìn)行原核表達(dá)，重組蛋白經(jīng)過(guò)鎳柱親和純化并尿素梯度透析復(fù)性后免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，利用CNBr激活的Sepharose4B對(duì)抗體進(jìn)行親和純化，獲得Dmrt1、Amh和Cyp11b2多克隆抗體。之后，利用Westernblot檢測(cè)1年齡尼羅羅非魚(yú)性腺組織Dmrt1、Amh和Cyp11b2表達(dá)，免疫組化方法檢測(cè)其在尼羅羅非魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期精巢和卵巢組織中表達(dá)情況，同時(shí)利用實(shí)驗(yàn)室已有的Cyp19a1a抗體，檢測(cè)Dmrt1、Am

6、h、Cyp11b2和Cyp19a1a在性逆轉(zhuǎn)性腺中的表達(dá)情況。
　　 Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Dmrt1多克隆抗體可以特異的識(shí)別Dmrt1重組蛋白，分子量約為35kD，同時(shí)，在精巢總蛋白識(shí)別單一條帶，而在卵巢并未檢測(cè)到條帶，證實(shí)Dmrt1抗體具有特異性，且Dmrt1在尼羅羅非魚(yú)只在精巢特異表達(dá)，而在卵巢組織幾乎不表達(dá)。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Dmrt1從性別決定關(guān)鍵時(shí)期5dah(dah，daysafterhatching)開(kāi)始

7、高表達(dá)于XY精巢Sertoli前體細(xì)胞，在精巢發(fā)育后期表達(dá)于Sertoli細(xì)胞和輸精管上皮細(xì)胞。同期的XX卵巢中未見(jiàn)表達(dá)。而在外源雌激素E2(Estradiol)誘導(dǎo)XY性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，到10-15dah時(shí)Dmrt1表達(dá)量明顯降低，到70dah已完全檢測(cè)不到，Letrozole（雌激素合成關(guān)鍵酶Cyp19ala抑制劑）誘導(dǎo)XX性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，Dmrt1在15dah時(shí)開(kāi)始表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸升高，到70dah時(shí)與XY對(duì)照組沒(méi)有差別。此結(jié)果暗示

8、，Dmrt1在尼羅羅非魚(yú)性別決定、精巢維持及性逆轉(zhuǎn)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　 同時(shí)，檢測(cè)性逆轉(zhuǎn)尼羅羅非魚(yú)性腺中Cyp19a1a發(fā)現(xiàn)，E2誘導(dǎo)XY性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，Cyp19a1a在10dah時(shí)開(kāi)始表達(dá)，隨后表達(dá)量逐漸上升，到60dah時(shí)與XX對(duì)照組沒(méi)有差別。Letrozole誘導(dǎo)XX性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，Cyp19a1a表達(dá)量逐漸減少并在60dah時(shí)消失。有趣的是，在E2和Letrozole處理10-15dah時(shí)，性腺組織同時(shí)表達(dá)Dmrt

9、1和Cyp19a1a。說(shuō)明在性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，存在雌雄通路的對(duì)抗作用。
　　 Westernblot檢測(cè)Amh多克隆抗體發(fā)現(xiàn)，該抗體可特異識(shí)別出Amh重組蛋白，分子量約為54kD，且在精巢和卵巢組織同時(shí)檢測(cè)到單一條帶，證實(shí)Amh抗體具有特異性，且Amh在尼羅羅非魚(yú)精巢和卵巢組織均有表達(dá)。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Amh在5-180dah均高表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞和鞘膜細(xì)胞，及精巢葉邊細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞。免疫組化檢測(cè)性逆轉(zhuǎn)性腺發(fā)現(xiàn)，Amh在

10、Letrozole誘導(dǎo)XX魚(yú)性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中表達(dá)量逐漸升高，而在E2誘導(dǎo)XY魚(yú)性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中表達(dá)不明顯，直到70dah才檢測(cè)到微弱的信號(hào)。本研究推測(cè)Amh在精巢發(fā)育早期發(fā)揮重要作用，并參與精子發(fā)生和精子運(yùn)輸過(guò)程，而在卵巢發(fā)育早期作用不明顯，待卵巢發(fā)育到一定時(shí)期才發(fā)揮作用。
　　 同樣的，Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cyp11b2抗體可以特異識(shí)別出分子量約為64kD的目的條帶，即Cyp11b2重組蛋白，同時(shí)，該抗體在精巢組織總蛋白識(shí)別

11、出一條大約58kD的內(nèi)源性條帶，而在卵巢并未檢測(cè)到條帶，這說(shuō)明Cyp11b2抗體具有特異性，并且Cyp11b2在羅非魚(yú)只在精巢特異表達(dá)，而在卵巢組織不表達(dá)。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cyp11b2特異表達(dá)于30dah以后的精巢Leydig細(xì)胞，而在性別決定關(guān)鍵時(shí)期5dah并不表達(dá)。Cyp11b2在Letrozole處理XX雌魚(yú)早期并不表達(dá)，在70dah時(shí)才檢測(cè)到信號(hào)。推測(cè)，Cyp11b2或者Cyp11b2催化合成的產(chǎn)物11-KT調(diào)節(jié)和維持精子發(fā)