青鳉性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察和DMY、Dmrt1基因的表達(dá)分析.pdf

1、青鳉(Oryzias latipes)體型小巧,是比較受歡迎的小型寵物魚(yú)。因其繁殖力強(qiáng)且繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、透明度高、受精情況易辨別、胚胎發(fā)育速度快、對(duì)水質(zhì)敏感等特點(diǎn),越來(lái)越被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)以及毒理學(xué)等研究領(lǐng)域,是研究脊椎動(dòng)物生殖細(xì)胞增殖、遺傳突變和疾病以及污染物的致毒效應(yīng)等的良好模式生物。為了更加詳細(xì)的獲得青鳉性別決定和控制的基礎(chǔ)資料,本研究從三個(gè)方面進(jìn)行闡述:一是利用特異性引物對(duì)青鳉的遺傳性別進(jìn)行鑒定;二是用蘇木

2、精-伊紅(HE)染液對(duì)青鳉不同發(fā)育階段的組織切片進(jìn)行染色觀察,獲得青鳉全面的性腺發(fā)育資料;三是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)DMY和Dmrt1基因在雌雄個(gè)體內(nèi)的表達(dá)差異,并結(jié)合青鳉不同發(fā)育時(shí)期的性腺組織切片觀察,對(duì)它們?cè)谛詣e決定中的功能進(jìn)行闡述。主要結(jié)果如下:
　　1.利用特異性引物鑒定青鳉的遺傳性別
　　現(xiàn)在已經(jīng)有許多關(guān)于青鳉遺傳性別鑒定方法的報(bào)道,但是這些已知的方法需要兩對(duì)特異性引物,而且,通過(guò)此類方法來(lái)鑒定青鳉的遺傳性別容易

3、出現(xiàn)錯(cuò)誤。我們利用Jawa har等設(shè)計(jì)的這對(duì)引物,優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)不僅能夠鑒出成魚(yú)的遺傳性別,對(duì)胚胎和幼魚(yú)也同樣適用。但我們用這對(duì)引物鑒定青鳉的遺傳性別,得到異于前人的結(jié)果(雄性兩條帶,一條片段大小為933bp,另一條片段大小為1906bp;雌性僅僅擴(kuò)增出一條片段大小為1906bp的帶),經(jīng)分析后,我們認(rèn)為我們的結(jié)果更加準(zhǔn)確。這對(duì)依賴于青鳉遺傳性別的生態(tài)和生物醫(yī)學(xué)的研究都大有裨益。
　　2.青鳉各個(gè)時(shí)期性腺組織的發(fā)育和分化
　　

4、本文以青鳉孵化后不同時(shí)期的生殖腺為材料,經(jīng)石蠟切片和HE染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察了青鳉性腺?gòu)某霈F(xiàn)、分化到成熟的發(fā)育過(guò)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn):孵化后5-10天的仔魚(yú)腹腔右側(cè)已經(jīng)可以觀察到生殖腺,生殖腺中的生殖細(xì)胞體積明顯比周圍的體細(xì)胞大;孵化后10天,青鳉的性腺開(kāi)始分化,雌、雄性個(gè)體的性腺出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的差異,在雌性生殖腺內(nèi)可以明顯觀察到生殖包囊結(jié)構(gòu);隨后,在青鳉雌、雄性生殖腺內(nèi)先后觀察到卵子和精子的發(fā)生過(guò)程;孵化后50天,首次觀察到卵巢腔結(jié)構(gòu)和成熟的

5、精子。除此之外,我們還觀察到兩性特征共存的現(xiàn)象,即,在遺傳性別為雄性的生殖腺內(nèi),同時(shí)觀察到卵母細(xì)胞和精子結(jié)構(gòu)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為發(fā)育生物學(xué)、遺傳生物學(xué)提供有價(jià)值的信息和珍貴的基礎(chǔ)資料。
　　3.DMY、Dmrt1基因的表達(dá)分析
　　目前,對(duì)DM Y基因是青鳉雄性性腺發(fā)育起始的“開(kāi)關(guān)”基因已經(jīng)有了較統(tǒng)一的認(rèn)識(shí);另一個(gè)關(guān)于青鳉性別控制的“明星”基因是D mr t1。這兩個(gè)基因都是青鳉雄性性腺發(fā)育的控制因子。但是,目前,我們并不清楚

6、DMY基因是如何控制青鳉雄性睪丸發(fā)育和分化的,我們也不清楚 D mr t1基因是如何參與到青鳉雄性性腺發(fā)育、分化和成熟的過(guò)程中。在本研究中,我們將青鳉性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察與DMY、Dmrt1基因的表達(dá)分析相結(jié)合,檢測(cè)DMY和Dmrt1基因在青鳉雌雄性個(gè)體內(nèi)的表達(dá)差異,期望能夠發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在青鳉性腺發(fā)育、分化和成熟時(shí)所起的作用。結(jié)果顯示,DM Y基因在青鳉雌雄性個(gè)體受精后的10天、15天內(nèi)表達(dá)量基本持平,直到青鳉雌雄個(gè)體的性腺開(kāi)始出現(xiàn)形