半滑舌鰨基因組編輯 TALEN 技術(shù)的建立及雄性決定基因dmrt1的功能分析.pdf

1、一、半滑舌鰨基因組編輯TALEN技術(shù)的建立
　　基因組編輯技術(shù)對(duì)于海洋動(dòng)物基因功能分析和基因工程育種具有重大意義和應(yīng)用價(jià)值，開展海水養(yǎng)殖動(dòng)物基因組編輯技術(shù)的研究，對(duì)于培育定點(diǎn)突變的海水養(yǎng)殖動(dòng)物新品種至關(guān)重要。但由于海水養(yǎng)殖魚類胚胎顯微注射技術(shù)難度大，至今少有成功的報(bào)道，加之海水魚類仔魚數(shù)量過(guò)少、難以培育成活等問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了海水魚類基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)程，迄今國(guó)內(nèi)外未見有關(guān)海水養(yǎng)殖魚類基因組編輯的成功報(bào)道。本研究成功建立了海水鲆

2、鰈魚類半滑舌鰨胚胎顯微注射技術(shù)及基因組編輯技術(shù)，并在性別決定基因功能驗(yàn)證上取得突破性進(jìn)展。將GFP質(zhì)粒成功顯微注射到半滑舌鰨胚胎中并表達(dá)；利用TALEN技術(shù)成功敲除了半滑舌鰨Z染色體上的dmrt1基因，并獲得了33尾基因突變魚。
　　二、半滑舌鰨dmrt1基因在性別決定及性腺發(fā)育過(guò)程中的功能
　　本研究通過(guò)靶向dmrt1基因的TALEN mRNA顯微注射到半滑舌鰨胚胎中，成功誘導(dǎo)dmrt1基因的突變，突變效率最高達(dá)100％。

3、ZZ型dmrt1突變魚發(fā)育成中間有一個(gè)腔的卵巢樣精巢，精子發(fā)生被阻斷。Dmrt1突變雄魚的性腺中雌性性別相關(guān)基因foxl2和cyp19a1a顯著性增加。Dmrt1突變雄魚比正常雄魚生長(zhǎng)快，與正常雌魚長(zhǎng)勢(shì)一樣。同時(shí)，檢測(cè)到1尾雌雄同體魚，該魚的遺傳性別為ZW型，其上側(cè)性腺外形上像精巢，下側(cè)性腺外形上像卵巢。上下側(cè)性腺切片染色結(jié)果顯示，上側(cè)性腺呈現(xiàn)典型的精巢結(jié)構(gòu)，而下側(cè)性腺則呈現(xiàn)卵巢樣結(jié)構(gòu)。采用PCR分析了雌雄同體魚性腺的dmrt1基因突變

4、情況，在上側(cè)的精巢中未檢測(cè)到的dmrt1基因的突變，而在下側(cè)的卵巢樣性腺中則檢測(cè)到dmrt1基因的許多突變。由此表明dmrt1基因是半滑舌鰨雄性精巢發(fā)育必不可少的基因，是半滑舌鰨的雄性決定基因，并且是關(guān)聯(lián)著生長(zhǎng)二態(tài)性。
　　三、半滑舌鰨雄性性別決定基因dmrt1突變家系的建立
　　通過(guò)基因組編輯技術(shù)敲除了半滑舌鰨dmrt1基因，將dmrt1基因定點(diǎn)突變魚培育至性成熟。然后分別在2015年和2016年通過(guò)人工繁育技術(shù)將篩選出的