半滑舌鰨免疫相關(guān)基因C8和SHP-1的克隆、重組表達和功能分析.pdf

1、魚類養(yǎng)殖在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有舉足輕重的地位，但日益頻發(fā)的病害問題嚴重制約了魚類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前產(chǎn)業(yè)上迫切需要有效的病害防治技術(shù)保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。對魚類免疫機理的深入研究是實現(xiàn)這一目標的根本途徑。半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，目前養(yǎng)殖產(chǎn)值達到10億元之多，但是細菌性和病毒性病害對半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重威脅，由于對半滑舌鰨抗菌和抗病毒免疫防御機理不清楚，缺乏有效病害防治措施。通

2、過半滑舌鰨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中抗病組、染病組和健康組的CsC8基因和CsSHP-1的表達量存在顯著差異，而且鑒于此CsC8基因和CsSHP-1在半滑舌鰨免疫系統(tǒng)中的重要性，本研究以半滑舌鰨為研究對象，對CsC8基因和CsSHP-1基因進行克隆鑒定、重組表達及功能分析，闡明半滑舌鰨抗病分子機制，為半滑舌鰨的病害防治提供重要理論基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　　對半滑舌鰨CsC8基因進行了克隆和驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨補體CsC8由CsC8α、Cs

3、C8β和CsC8γ3條鏈組成，分別由CsC8α、CsC8β和CsC8γ編碼，其中CsC8α基因包含了1797 bp的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼598個氨基酸，CsC8β基因包含了1749 bp的開放閱讀框，編碼582個氨基酸，CsC8γ基因包含了666 bp的開放閱讀框，編碼221個氨基酸。將CsC8α、CsC8β和CsC8γ的基因比對半滑舌鰨基因組，發(fā)現(xiàn)CsC8α和CsC8β位于20號染色體上，而

4、CsC8γ位于第3號染色體上，并不是線性分布的。CsC8α、CsC8β和CsC8γ在13種健康組織中的表達情況顯示，CsC-8α、CsC8β和CsC8γ在不同組織中均有表達，其中肝臟中表達量最高，其次是脾臟和卵巢；感染鰻弧菌后，CsC8α基因在6種免疫組織中整體均表現(xiàn)出上調(diào)表達趨勢，不同組織對鰻弧菌的敏感度不同，CsC8α基因在不同組織的表達量峰值出現(xiàn)的時間點也不同，其中肝臟（48h）、血液（48h）、脾臟（12h）、腸（12h）、頭腎

5、（24h）和鰓（6h），而且CsC8α在血液中表達量變化最明顯，48h時的表達量達到0h的119.3倍（P＜0.01）；CsC8β基因在6種免疫組織中整體表現(xiàn)出上調(diào)表達趨勢，CsC8β基因在肝臟、脾臟和鰓中都是在24h出現(xiàn)表達的最高，在腸中是在6h出現(xiàn)表達的最大值，表現(xiàn)出組織敏感性，在血液中出現(xiàn)了反常，在6h和24h表達上調(diào)后開始下調(diào)，但在72h出現(xiàn)表達的峰值，在頭腎中，12h和48h表達量達到峰值，而且CsC8β在頭腎中表達量變化最為

6、明顯，12h的表達量為0h的17.8倍（P＜0.01）；CsC8γ基因在6種免疫組織中整體表現(xiàn)出上調(diào)表達趨勢，CsC8γ基因在肝臟、頭腎、脾臟、腸和鰓中都是在12h出現(xiàn)表達的最高峰，在血液中，CsC8γ的表達量變化最為明顯，72h的表達量為0h的48.3倍（P＜0.01）。重組蛋白CsC8α體外抑菌實驗結(jié)果顯示，重組蛋白CsC8α對鰻弧菌的抑制效果最為明顯，抑菌率隨著重組蛋白濃度的增加明顯升高；對愛德華氏菌和副溶血弧菌的抑菌效果明顯弱于

7、對鰻弧菌的抑菌效果，但也表現(xiàn)出了一定的抑菌作用；當重組蛋白濃度超過0.3mg/ml后，也只達到0.5以上；對于革蘭氏陽性菌的代表菌株金黃色葡萄球菌，重組蛋白對其抑菌效果不明顯，抑菌率一直在0.5以下，在最高濃度0.5mg/ml時抑菌率才達到0.43，得不到明顯的抑菌效果。上述結(jié)果表明，半滑舌鰨補體基因C8在免疫應答反應中發(fā)揮重要作用，尤其是對細菌性病原菌引起的免疫反應和對革蘭氏陰性菌的抑制作用。
　　通過RACE和PCR技術(shù)獲得半

8、滑舌鰨CsSHP-1基因的cDNA全長，CsSHP-1的cDNA全長2045bp，編碼區(qū)共包含1743bp，控制編碼580個氨基酸。SMART結(jié)構(gòu)域預測分析得知CsSHP-1基因共包含2個SH2結(jié)構(gòu)域，1個PTPc結(jié)構(gòu)域；通過氨基酸多序列比對結(jié)果顯示，半滑舌鰨SHP-1與尼羅羅非魚Oreochromis niloticus的相似度最高，達到82％；系統(tǒng)進化樹顯示魚類的SHP-1首先聚為一支然后再與高等脊椎動物聚在一起。CsSHP-1基因

9、在13種健康組織中的表達分析顯示，半滑舌鰨CsSHP-1在各個組織中均有表達，在脾臟中的表達量最高，心臟中的表達最低；感染鰻弧菌后在6種免疫組織肝、脾、小腸、頭腎、鰓、血液中均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達，但是峰值出現(xiàn)的時間點不同；用4種病原模擬物處理半滑舌鰨外周血淋巴細胞后，除PolyI：C處理后表達量呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)趨勢外，其他實驗組出現(xiàn)上調(diào)表達趨勢，但不是很明顯。為了進一步探究CsSHP-1的功能，本研究在畢赤酵母真核表達系統(tǒng)成功表達出分子

10、量為67kDa的重組CsSHP-1，用CCK-8法測試重組蛋白CsSHP-1對人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549和人乳腺癌細胞MDA-MB-231三種癌細胞的體外細胞毒活性及強度。結(jié)果顯示：重組蛋白CsSHP-1對3種癌細胞均有不同程度的細胞毒活性，其細胞毒活性強度順序為：人肝癌細胞HepG2>人乳腺癌細胞MDA-MB-231>人肺癌細胞A549。
　　綜上所述：半滑舌鰨免疫相關(guān)基因C8和SHP-1在免疫應答中發(fā)揮著作用，對