半滑舌鰨StAR基因的克隆和表達(dá)分析及性別相關(guān)基因(FTZ-F1、neurl3)原位雜交分析.pdf

1、半滑舌鰨是我國(guó)一種重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi),由于半滑舌鰨營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,具有廣闊的養(yǎng)殖前景。并且在發(fā)育過(guò)程中,半滑舌鰨雌雄差異大,在自然條件下容易發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。因此,研究半滑舌鰨性別控制的相關(guān)基因決定機(jī)制是一個(gè)十分重要的研究方向。本文通過(guò)對(duì)半滑舌鰨StAR基因的克隆,發(fā)現(xiàn)該基因在半滑舌鰨精巢的表達(dá)量明顯,推測(cè)該基因?qū)驳陌l(fā)育和精細(xì)胞的發(fā)生有密切關(guān)系,對(duì)半滑舌鰨在性別相關(guān)基因的挖掘工作做了很好的基礎(chǔ)性工作,為進(jìn)一步研究性別相關(guān)基因提供基礎(chǔ)性材料。

2、
　　利用半滑舌鰨性腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的StAR基因部分序列,設(shè)計(jì)RACE引物,克隆了半滑舌鰨StAR基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1294bp,5′端UTR為132bp,3′端UTR為310bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)為852bp,共編碼283個(gè)氨基酸。將半滑舌鰨StAR基因與其他物種StAR基因進(jìn)行氨基酸同源性分析,結(jié)果顯示,半滑舌鰨StAR與塞內(nèi)加爾鰨、大口黑鱸、花鱸、金頭鯛的同源性都達(dá)到了85℅,和虹鱒、斜帶石斑魚(yú)及日本鰻鱺的同源性

3、分別為81℅、83℅和76℅。StAR基因的雌、雄魚(yú)不同組織表達(dá)分析表明,StAR基因在雄魚(yú)性腺中高表達(dá),在雄魚(yú)的肝臟、腦及心臟中表達(dá)量較低,而在雄魚(yú)的其它組織中不表達(dá);在雌魚(yú)腸中不表達(dá),在其它組織(卵巢、肝臟、脾臟、腦、垂體、肌肉、心臟、腎臟)中微量表達(dá)。熒光定量PCR分析不同組織與不同時(shí)期性腺表達(dá)譜表明,雄魚(yú)性腺中StAR基因的表達(dá)量顯著高于雌、雄魚(yú)其它各組織(p<0.05),提示StAR基因?qū)π埕~(yú)精巢發(fā)育起重要作用。雄魚(yú)不同時(shí)期表

4、達(dá)譜分析結(jié)果顯示:StAR基因在66天前的精巢中不表達(dá),在150天時(shí)表達(dá)量急劇增加,至二齡時(shí)表達(dá)量最高,三齡時(shí)表達(dá)量下降,說(shuō)明該基因在精巢發(fā)育成熟過(guò)程中起重要作用。原位雜交結(jié)果顯示StAR基因主要在雄魚(yú)精巢的精子細(xì)胞中表達(dá),而在半滑舌鰨雌魚(yú)的卵巢中不表達(dá)。通過(guò)以上研究表明,StAR基因在半滑舌鰨精巢發(fā)育中發(fā)揮作用,且可能在精子形成中發(fā)揮重要作用,為進(jìn)一步研究StAR基因在半滑舌鰨生殖調(diào)控中的功能和作用機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　對(duì)早

5、期半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期的性腺進(jìn)行組織學(xué)分析。通過(guò)觀察可以發(fā)現(xiàn)該批采集的魚(yú)苗,26d雌魚(yú)、雄魚(yú)都沒(méi)有發(fā)生分化,性腺中聚集大量的原始生殖細(xì)胞。46d雌魚(yú)、雄魚(yú)雌魚(yú)沒(méi)有明顯的分化,雌魚(yú)性腺中出現(xiàn)卵原細(xì)胞,雄魚(yú)性腺中有精原細(xì)胞。66d雌魚(yú)性腺出現(xiàn)多個(gè)隆起,卵原細(xì)胞增多,66d雄魚(yú)精巢中有輸精小管的形成,在此時(shí)期已經(jīng)有明顯的分化。86d雌魚(yú)可以觀察到明顯的卵巢腔的出現(xiàn),說(shuō)明卵巢的分化已經(jīng)正式開(kāi)始,86d雄魚(yú)也產(chǎn)生了大量的次級(jí)精母細(xì)胞,有精小葉結(jié)構(gòu)

6、形成,有多個(gè)裂隙結(jié)構(gòu)。關(guān)于半滑舌鰨早期性腺分化的具體時(shí)期還沒(méi)有明顯的界定,因?yàn)樾韵俚陌l(fā)育會(huì)受到多種因素的影響,其中溫度對(duì)半滑舌鰨性腺發(fā)育的影響明顯。已經(jīng)證明卵巢的腔的形成為卵巢分化形成的重要標(biāo)志。
　　通過(guò)原位雜交技術(shù),分別對(duì)FTZ-F1基因和neurl3基因進(jìn)行了組織學(xué)定位。結(jié)果顯示FTZ-F1基因在半滑舌鰨的雌魚(yú)和雄魚(yú)中都有雜交信號(hào),但在精巢中的雜交信號(hào)明顯強(qiáng)烈,隨著精巢的成熟雜交信號(hào)明顯加強(qiáng),44d的雄魚(yú)主要在精原細(xì)胞中信號(hào)

7、最強(qiáng),205d的精巢中雜交信號(hào)主要集中在精子細(xì)胞中。卵巢中該基因的雜交信號(hào)較弱,44d的雌性原始性腺中原始生殖細(xì)胞有較弱的表達(dá),在205d的雌魚(yú)卵巢中該基因主要在卵母細(xì)胞的膜中表達(dá)。neurl3基因原位雜交表達(dá)分析結(jié)果顯示,該基因在半滑舌鰨的精巢中表達(dá)信號(hào)強(qiáng),2齡的雄魚(yú)中檢測(cè)到了該基因的雜交信號(hào),雜交信號(hào)主要集中在成熟的精子細(xì)胞表達(dá),成年的卵巢中沒(méi)有該基因的表達(dá)。對(duì)于三倍體的半滑舌鰨雄魚(yú)也檢測(cè)到了該基因的表達(dá),但表達(dá)程度明顯比正常的雄魚(yú)