半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)R-spondin1和R-spondin3基因的克隆與表達分析.pdf

1、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國極其重要的海洋養(yǎng)殖經濟魚類，雌雄個體差異較大。R-spondin（Rspo）蛋白家族共有4位成員，Rspo1-4，為分泌性蛋白。Rspo蛋白家族成員含有相似度很高的保守結構域:2個富含半胱氨酸的furin-like結構功能域(furin-like cysteine rich domain，FU)和1個血小板反應蛋白結構域(thrombospondin-type1 domain

2、，TSP1)。已知所有的成員蛋白均能與Wnt信號通路相互作用，在脊椎動物發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的功能。Rspo1基因作為一個卵巢決定和分化的最佳候選基因，在性別決定、皮膚分化和惡性腫瘤等方面都具有重要的功能。Rspo3基因能調控造血干細胞命運、促進血管生成、調控哺乳動物胎盤發(fā)育等等。本實驗主要是通過同源克隆技術和RACE PCR技術(Rapid amplification of cDNA ends PCR)分離出半滑舌鰨Rspo1基因和R

3、spo3基因的cDNA全長，利用原位雜交和熒光定量PCR對其基因表達進行了研究，結合所得到的結果通過生物信息學分析，對這2個基因的功能進行了預測。具體總結如下:
　　(1)半滑舌鰨Rspo1基因的克隆和表達分析
　　利用同源比對得到的簡并引物和RACE引物，克隆分離出半滑舌鰨Rspo1基因ORF全長為834 bp，編碼277個氨基酸，分子量大小約為30.52 kDa。蛋白質結構預測其含有FU1、FU2、TSP1結構域，分別位

4、于31-86、93-137和154-216處，蛋白比對結果表明半滑舌鰨Rspo1基因氨基酸序列與其他物種尤其是海洋魚類的Rspo1基因氨基酸序列相似度比較高，系統(tǒng)進化樹的分析也驗證了上述結果。進化樹明顯的分為兩大枝:魚類該基因分化較大，物種間相似度只有40％-60％，而四足類動物中達到了99％以上。分析預測啟動子區(qū)的轉錄因子，發(fā)現存在性別相關轉錄因子Sox-5，SRY的結合位點，這對研究該基因功能提供了幫助。實時熒光定量PCR(qRT-

5、PCR)結果表明半滑舌鰨Rspo1基因在胚胎時期的表達主要是從克氏泡時期之后開始明顯升高。鑒于其在性別分化中的作用，我們比較了該基因在雌雄組織中的差異表達，發(fā)現雌雄各組織中均有表達，其中卵巢中的Rspo1基因表達量顯著高于精巢，是精巢表達量的2倍，這與先前的報道結果相一致，暗示了Rspo1基因在性別決定中的重要作用;非性腺組織如腦、心等也有表達但雌雄表達差異很小。性腺組織切片原位雜交結果顯示Rspo1基因主要定位在半滑舌鰨卵巢的卵母細胞

6、的細胞核以及精巢的精原細胞和精母細胞中，精細胞中無信號，這與斑馬魚中Rspo1基因的研究結果相一致。相同濃度探針雜交后卵巢中的信號要比精巢中的強，也間接說明Rspo1基因在卵巢中的表達量高于精巢。借助斑馬魚這個模式生物，我們探究了體外注射半滑舌鰨Rspo1基因對于斑馬魚發(fā)育以及Wnt信號通路的影響。注射半滑舌鰨Rspo1-GFP質粒后綠色熒光信號可出現在身體的大多數位置，同時導致胚胎畸形率升高;當在胚胎中過量表達半滑舌鰨Rspo1基因和

7、Wnt3a基因mRNA后，Wnt信號通路受到了抑制。
　　(2)半滑舌鰨Rspo3基因的克隆和表達分析
　　同樣通過同源克隆和RACE技術，分離出半滑舌鰨Rspo3基因ORF全長共987 bp，編碼328個氨基酸，分子量大小約為38.07 kDa。蛋白質結構預測該基因除了含有FU1(36-88)、FU2(94-137)、TSP1(200-257)保守結構域外，還含有1個FU3(141-185)結構域。經比對分析后發(fā)現，3個F

8、U保守結構域是魚類Rspo3基因所特有的，哺乳動物如人類和小鼠Rspo3基因就不存在這種現象。系統(tǒng)進化樹中Rspo3基因聚為兩大類:魚類和哺乳類，而且魚類中明顯分為海水魚和淡水魚，進化關系更為明確。qRT-PCR結果顯示出半滑舌鰨Rspo3基因在成魚各組織中均有表達，尤其以腦和鰓組織表達量最高。體外注射半滑舌鰨Rspo3-GFP質粒對于斑馬魚發(fā)育具有顯著的影響，正常發(fā)育的胚胎熒光信號少而集中于肌肉中，畸形胚胎出現尾部蜷曲、縮短，頭部發(fā)育