半滑舌鰨性別相關(guān)基因DAZL和WT1a的克隆與表達分析.pdf

1、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）因具有生長快、口感鮮美、市場價值高等特點，是一種理想的增養(yǎng)殖對象。但是半滑舌鰨雌性的生長速度是雄性的2-3倍，且存在天然的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，性逆轉(zhuǎn)后的偽雄魚繁殖能力差，后代偽雄魚比例高。因而研究半滑舌鰨的性別決定機制，實現(xiàn)單性育種對于半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟意義。本文克隆了半滑舌鰨DAZL和WT1a基因，發(fā)現(xiàn)它們均是半滑舌鰨性別相關(guān)基因。通過研究這兩個基因的表達情況，尤其是與性

2、腺分化早期的組織學觀察結(jié)合起來，不僅有利于闡明DAZL基因和WT1a基因在ZZ/ZW型魚類的性腺分化中的作用，而且為找出半滑舌鰨性別決定的關(guān)鍵控制基因以及實現(xiàn)全雌育種提供基礎(chǔ)材料和理論依據(jù)。
　　本文通過組織切片觀察半滑舌鰨性腺的分化和發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)該批仔魚雌性性腺在46天之前雄魚性腺分化不明顯。56天時，雌性仔魚性腺開始出現(xiàn)不規(guī)則的溝壑，出現(xiàn)卵巢腔，說明性腺開始分化，并且雄性性腺的分化晚于雌性性腺。另外對成魚的性腺切片觀察發(fā)現(xiàn)性

3、逆轉(zhuǎn)后的雌魚性腺中有大量的精子，且與正常雄魚的性腺切片差異不大。
　　本研究利用RACE技術(shù)克隆了半滑舌鰨DAZL基因的全長。通過測序和拼接獲得了半滑舌鰨DAZL基因的cDNA序列2026bp，含有636bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼211個氨基酸，編碼產(chǎn)物含有典型的RNA識別基序RRM和DAZ重復(fù)序列。熒光定量PCR結(jié)果顯示，DAZL基因在半滑舌鰨性腺特異表達，并且DAZL基因在雄魚中的表達量顯著高于雌魚和偽雄魚，但在雌魚

4、和偽雄魚性腺中表達量差異不大，說明DAZL基因并不是性逆轉(zhuǎn)的標志性基因，在生理性別為雄性的偽雄魚性腺中仍然保持正常雌魚的表達模式。在胚胎發(fā)育各時期的表達結(jié)果顯示，DAZL基因在受精后20h（神經(jīng)胚期）之前表達量較高，并在20h達到最高值，而20h以后表達迅速降低，可能是20h以后原始生殖細胞的形成導(dǎo)致。在仔魚發(fā)育各時期的表達結(jié)果顯示，DAZL在仔魚發(fā)育25d至65d表達量呈上升趨勢，并且在雌魚46d時出現(xiàn)顯著升高，在雄魚56d時出現(xiàn)顯著

5、升高，與仔魚的性腺的分化時期相吻合。這些結(jié)果說明，DAZL基因是半滑舌鰨性別特異基因，但并沒有參與性反轉(zhuǎn)的過程，并且可能在半滑舌鰨性腺的分化過程中起重要作用。
　　本文從半滑舌鰨全基因組序列中獲得 WT1a的部分序列，然后利用同樣的方法克隆了WT1a基因的全長?？寺〗Y(jié)果顯示：WT1a基因全長cDNA為1886bp，開放閱讀框（ORF）長為1470bp，編碼490個氨基酸，并且包含 KTS三肽，5'UTR和3'UTR分別長為245b

6、p和171bp。在ORF末端發(fā)現(xiàn)2個微衛(wèi)星（SSR）序列和2個跨膜螺旋區(qū)域，而在其他物種中未發(fā)現(xiàn)該序列，經(jīng)驗證該序列在半滑舌鰨中普遍存在，這可能是半滑舌鰨所特有的。氨基酸序列分析顯示W(wǎng)T1a基因的保守性很高，與人的同源性也高達90％。熒光實時定量分析結(jié)果顯示：WT1a在雌魚和雄魚性腺中表達顯著高于其它各組織，并且在雄魚性腺中的表達顯著高于雌魚，在雌魚性腺中的表達又顯著高于偽雄魚，說明該基因是性別相關(guān)基因。在胚胎發(fā)育各時期以及初出膜后的表