半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)線(xiàn)粒體基因組全序列和性別相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、本研究克隆和測(cè)序得到半滑舌鰨mtDNA全序列,半滑舌鰨mtDNA全長(zhǎng)16731bp,由13個(gè)蛋白編碼、2個(gè)rRNA、22個(gè)tRNA基因、1個(gè)控制區(qū)和3個(gè)非編碼區(qū)構(gòu)成。ND6和7個(gè)tRNA由L-鏈編碼,其余H-鏈編碼,半滑舌鰨mtDNA存在基因移位和倒位現(xiàn)象,控制區(qū)、tRNAnIle和tRNAGln發(fā)生移位,tRNAGln由L-鏈編碼轉(zhuǎn)為H-鏈編碼。根據(jù)重復(fù)復(fù)制剪切理論和基因重組理論,對(duì)基因倒位和移位的機(jī)制構(gòu)建模型,模型一:由典型脊椎動(dòng)物

2、線(xiàn)粒體基因組經(jīng)過(guò)兩次重復(fù)復(fù)制,兩次隨機(jī)剪切,一次H-鏈與L-鏈的交換重組;模型二:經(jīng)過(guò)一次重復(fù)復(fù)制,一次基因重組,兩次隨機(jī)剪切;模型三:線(xiàn)粒體內(nèi)部重組造成基因移位和倒位。選擇12S和16SrRNA、ND2、ND4、ND5、Cytb、COI、COII、COIII這7個(gè)蛋白編碼基因的氨基酸序列,以及核苷酸序列分別構(gòu)建ML系統(tǒng)樹(shù)。三個(gè)結(jié)果都顯示鰈形目魚(yú)類(lèi)與鱸形目親緣關(guān)系最近,與鱸形目魚(yú)類(lèi)聚為一支,再與觸形目魚(yú)類(lèi)聚類(lèi),這說(shuō)明鰈形目魚(yú)類(lèi)與鱸形目魚(yú)

3、類(lèi)和觸形目魚(yú)類(lèi)有較近的親緣關(guān)系。
　　 半滑舌鰨Sox9a基因cDNA全長(zhǎng)1842bp,ORF長(zhǎng)1461bp,編碼487個(gè)氨基酸,Sox9a在雄性的腦、垂體和性腺中的表達(dá)都顯著高于雌性,這顯示Sox9a基因在半滑舌鰨的腦-垂體-性腺軸上起重要的作用。發(fā)現(xiàn)偽雄魚(yú)中的相對(duì)表達(dá)量要顯著高于對(duì)照組的雌魚(yú),這預(yù)示Sox9基因與性逆轉(zhuǎn)存在必然的聯(lián)系,但是基因的高表達(dá)是性逆轉(zhuǎn)的結(jié)果還是導(dǎo)致性逆轉(zhuǎn)的必要條件不能確定。Sox9基因在胚胎發(fā)育的原腸

4、期顯著高表達(dá),Sox9基因也許在胚胎時(shí)期的細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用。Sox9a在孵化后43d表達(dá)達(dá)到最高峰,說(shuō)明Sox9a基因在半滑舌鰨性別分化過(guò)程中起一定的作用。Sox9a基因在9月齡的半滑舌鰨精巢中的表達(dá)達(dá)到高峰,對(duì)半滑舌鰨精原細(xì)胞的形成起重要的作用。
　　 同源克隆半滑舌鰨Dmrt3基因的部分cDNA片段,實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果顯示,Dmrt3基因在雄性個(gè)體的性腺組織中高表達(dá),而在雌性個(gè)體各組織的表達(dá)量都相對(duì)很低。此外,高溫處理組的

5、偽雄魚(yú)性腺中Dmrt3的表達(dá)與對(duì)照組雌性性腺中的表達(dá)無(wú)顯著差異。甲基睪酮處理組的雄魚(yú)和偽雄魚(yú)性腺中Dmrt3的表達(dá)都顯著高于對(duì)照組雄性,說(shuō)明Dmrt3基因與性反轉(zhuǎn)不存在必然聯(lián)系。在不同時(shí)期精巢中的表達(dá)結(jié)果預(yù)示,Dmrt3可能在精巢的發(fā)育過(guò)程中起重要作用。
　　 通過(guò)同源擴(kuò)增和基因組Walking,得到半滑舌鰨Dmrt4基因的DNA序列,長(zhǎng)度為2271bp,包含一個(gè)內(nèi)含子、兩個(gè)外顯子,外顯子1長(zhǎng)度486bp,外顯子2的長(zhǎng)度為720

6、bp,編碼長(zhǎng)度為426個(gè)氨基酸的蛋白序列,內(nèi)含子長(zhǎng)度154bp。Dmrt4基因在半滑舌鰨的雄性的腦-垂體-性腺軸上起重要作用,是一個(gè)雄性?xún)?yōu)勢(shì)表達(dá)的基因,但與性反轉(zhuǎn)并無(wú)必然聯(lián)系。Dmrt4基因在胚胎發(fā)育的原腸期表達(dá)量最高,顯著高于其它幾個(gè)時(shí)期,從尾芽形成期開(kāi)始恢復(fù)到多細(xì)胞期的表達(dá)水平,之后幾個(gè)時(shí)期Dmrt4基因的表達(dá)無(wú)顯著變化,保持恒定一直到出膜前。孵化后37d到43d Dmrt4呈現(xiàn)高表達(dá),可能與半滑舌鰨的性別分化存在密切的聯(lián)系。Drm

7、a4基因與性腺的發(fā)育有一定的關(guān)系,有可能是促進(jìn)雄性性腺發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子。
　　 半滑舌鰨Daxl基因cDNA全序列長(zhǎng)1333bp,5'-UTR區(qū)112bp,3'-UTR區(qū)324bp,ORF長(zhǎng)897bp,編碼299個(gè)氨基酸。Daxl在6個(gè)組織中都有表達(dá),表達(dá)的差異很大,在腦、垂體和性腺中的表達(dá)較高,尤其是雄性性腺中的表達(dá)。Daxl基因在不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在多細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)很高,隨后逐漸降低。在高

8、溫處理和甲基睪酮處理組的表達(dá)顯示,Daxl與半滑舌鰨的性反轉(zhuǎn)存在必然的聯(lián)系,可能對(duì)維持性反轉(zhuǎn)之后偽雄魚(yú)性腺的功能和性狀起重要的作用。Daxl基因的表達(dá)存在一定的階段性,在性腺發(fā)育的某個(gè)時(shí)期起關(guān)鍵的作用,在其它時(shí)期不表現(xiàn)出很強(qiáng)的表達(dá)。
　　 從半滑舌鰨中克隆了Foxl2基因cDNA全序列,全長(zhǎng)1817bp,編碼308個(gè)氨基酸。Foxl2在雌性的腦、垂體和性腺中表達(dá)量顯著高于雄性,在原腸期的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它胚胎發(fā)育時(shí)期。Fox